[發明專利]革蘭陰性菌脂多糖(內毒素)比色檢測試劑盒的制備及其使用方法

無效

• 申請號: 201010552719.8
• 申請日: 2010-11-22
• 公開（公告）號: CN102305788A
• 公開（公告）日: 2012-01-04
• 發明（設計）人: 苑慶華;何永勝
• 申請（專利權）人: 天津市一瑞生物工程有限公司
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.革蘭陰性菌脂多糖(內毒素)比色檢測試劑盒的制備及其使用方法，以人工合成顯色基質Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、Boc-leu-Gly-Arg-DIAN或Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)，利用微量細菌內毒素特異性地激活東方鱟血細胞裂解物中含有的C因子、凝固酶原及凝固蛋白原，從而誘發東方鱟血細胞裂解物凝固化反應.被激活的凝固酶水解合成顯色基質釋放出顯色基團DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)，DIAN與顯色劑A(1-萘酚-4-磺酸鈉、1-萘酚-2-磺酸鈉或1-萘酚-5-磺酸鈉)在高碘酸鈉顯色劑B的存在下生成藍色縮合物，在630-680nm波長處，酶原激活量與形成的縮合物的吸收度在一定范圍內呈線形關系，從而定量檢測出樣品中細菌內毒素濃度；試驗過程應嚴格按照使用說明書上具體操作方法進行操作，同時要注意一些操作過程中的注意事項；該試劑盒可以用來早期診斷臨床革蘭陰性菌敗血癥感染，作為臨床診斷的參考之一。

2.如權利要求1所述的人工合成顯色基質包括Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、Boc-leu-Gly-Arg-DIAN及Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)三種。

3.如權利要求1所述的顯色劑A包括1-萘酚-4-磺酸鈉、1-萘酚-2-磺酸鈉及1-萘酚-5-磺酸鈉以及顯色劑B(高碘酸鈉)等。

4.如權利要求1所述的所生成的藍色縮合物，在630-680nm波長處，酶原激活量與形成的縮合物的吸光度在一定范圍內呈線形關系。

5.如權利要求2所述的人工合成顯色基質的濃度為1-10Mol之間，配制后分裝冷凍干燥或溶液在2-8℃避光保存，Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)核磁圖見說明書附圖3。

6.如權利要求3所述的顯色劑1-萘酚-4-磺酸鈉、1-萘酚-2-磺酸鈉及1-萘酚-5-磺酸鈉的濃度為0.2-10Mol之間，并使用0.05-5Mol硼酸緩沖液配制(pH?8.5-8.9)，其顯色劑高碘酸鈉的濃度為0.2-20％之間，使用滅菌注射用水配制，分裝在棕色瓶中冷凍干燥或溶液在2-8℃避光保存。

7.如權利要求1所述的試劑盒具體操作方法為：將反應主劑掰開，加入反應主劑用溶解液0.1ml，輕輕混勻溶解，分別加入標準品稀釋系列、陰性對照及待測樣品各0.1ml，37℃保溫60-120分鐘；之后分別加入0.1ml合成顯色基質，37℃保溫15分鐘；(或使用顯色基質用溶解液0.6ml溶解顯色基質混勻，然后再溶解反應主劑；取出0.1ml，分別加入標準品稀釋系列、陰性對照及待測樣品各0.1ml，37℃保溫60-120分鐘)取出振搖均勻，然后加入顯色劑A?50ul混勻，之后加入0.1ml顯色劑B混勻，室溫放置5-20分鐘，最后在波長630-680nm檢測吸光度值，計算含量。

8.如權利要求1所述的試劑盒使用過程中注意外環境的影響以及所使用器具中含有的細菌內毒素的污染，會對測定值產生影響；尤其是顯色試劑添加前操作一定要避免微生物以及細菌內毒素的污染。