[發明專利]飛秒激光誘變米根霉選育富馬酸高產菌株的方法

無效

• 申請號: 201010551640.3
• 申請日: 2010-11-22
• 公開（公告）號: CN102061294A
• 公開（公告）日: 2011-05-18
• 發明（設計）人: 聞建平;于守智
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N13/00
• 分類號: C12N13/00;C12N1/14;C12R1/845
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 王麗

技術領域

本發明屬于微生物誘變技術領域，特別涉及利用飛秒激光誘變米根霉選育富馬酸高產菌株的方法。

背景技術

進入21世紀以來，石油資源的供應已無法滿足石油化工產業發展的需要，而且產品生產和使用過程中的污染問題一直得不到根治。因此迫切需要改變生產原料來源和變更加工路線。隨著生物技術的不斷進步與發展，生物基產品替代石油基產品已經成為時代的主流。某些一碳、二碳、三碳、四碳及多碳的生物基產品可以作為大宗化學品直接運用到現代化學工業中，從而解決環境、社會的可持續發展問題。

“米根霉”(英文名稱“Rhizopus?oryzae”)是一種根霉屬絲狀真菌，其發酵產物可提取富馬酸(英文名“fumaric?acid”)，富馬酸是一種擁有兩個羧基和一個雙鍵的四碳二元羧酸，化學名稱為：反丁烯二酸。

富馬酸被美國能源部列為優先發展的十二種平臺化合物之一，可以通過氨化、水合、加氫及異構等工藝生產L-天冬氨酸、蘋果酸、琥珀酸、1，4-丁二醇、馬來酸等化合物。同時富馬酸也是一種含有雙鍵的二元羧酸，作為重要的有機化工原料和精細化工產品被廣泛應用于材料(樹脂、涂料及增塑劑等)、醫藥、化工、食品及飼料添加劑等領域。

據統計2005年，全球的富馬酸年產量為34萬噸，其中我國的富馬酸年產量已超過4萬噸，由于菌種的生產能力弱等原因，未見生物發酵法生產富馬酸的工業化實例，可見采用高效的飛秒誘變技術改良富馬酸生產菌株迫在眉睫。

激光誘變技術在微生物誘變育種中的應用較為廣泛，其作用于微生物細胞產生光、熱、壓力、點、電磁場、弱磁場作用等，改變了微生物細胞中DNA和RNA遺傳密碼的次序，引起變異。盧文玉等(盧文玉，聞建平，范晶華，曹博翔，孫冰.激光誘變玫瑰孢鏈霉菌結合鏈霉素抗性篩選法選育達托霉素高產菌株，微生物學通報，2006，33(3)：114-117)用He-Ne激光誘變處理玫瑰鏈霉菌，得到正突變株的達托霉素產量比原始菌株提高39％。馬麗娟等(Lijuan?Ma，Wenyu?Lu，Zhendong?Xia，Jianping?Wen*，Enhancement?ofdihydroxyacetone?production?by?a?mutant?of?Gluconobacter?oxydans，BiochemicalEngineering?Journal，2010；49(1)：61-67)用He-Ne激光誘變處理氧化葡萄糖酸桿菌，得到正突變株的DHA產量比原始菌株提高91.5％。韓建榮等(韓建榮，董仙芳.激光誘變青霉PT95原生質體選育類胡蘿卜素高產菌株，微生物學通報，2002，29(2)：31-34)采用激光對青霉PT95菌株的原生質體進行了誘變處理，選育到一株類胡蘿卜素提高28.3％的突變菌株。而把飛秒激光應用在生產富馬酸菌種的選育方面，則未見相關專利和文獻報道。

發明內容

本發明的目的是提出一種飛秒激光誘變米根霉選育富馬酸高產菌株的方法，依此方法可以有效地提高富馬酸的產量。

本發明的目的是通過如下技術方案實現的：

1)將米根霉(ATCC?20344)，在室溫下，制備10⁴～10⁶個孢子/mL的孢子懸液；

2)采用波長為800nm、重復頻率為76MHZ的飛秒激光，在照射功率為5～40mW、照射距離6cm、激光束直徑6mm下，對該孢子懸液輻照5～30s；

3)涂布平板培養，搖瓶篩選高產菌株。

所述的涂布平板培養的方法是：把經輻照處理的孢子懸液經無菌去離子水稀釋100～10000倍后涂布于PDA培養基平板，35℃暗室培養至出現單菌落，再將每個單菌落分別挑取至一個PDA培養基平板中，用無菌去離子水洗下孢子接種于盛有40mL液體發酵培養基的250mL搖瓶，于33～35℃，180～220rpm搖床中培養60～84h，從而獲得誘變的遺傳性狀穩定的純種米根霉菌株。

所述的液體發酵培養基組成及質量含量為：葡萄糖80g、尿素0.1g、KH₂PO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O?0.6g、ZnSO₄·7H₂O?0.018g、FeSO₄·7H₂O?0.001、CaCO₃55g，溶解在1L蒸餾水中，初始PH為5.5