[發明專利]一種T載體介導的測定5′端側翼未知序列的方法

無效

• 申請號: 201010550843.0
• 申請日: 2010-11-19
• 公開（公告）號: CN102140500A
• 公開（公告）日: 2011-08-03
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;唐存多;高金湖;譚中標;李劍芳;陳偉;張慧敏
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，是一種涉及限制性內切酶(Restriction?Endonuclease)酶切、pUCm-T載體連接和巢式PCR(Nest?Polymerase?Chain?Reaction)擴增等技術，基于部分已知DNA(Deoxyribonucleic?Acid)序列確定其5′端側翼未知DNA序列的方法。

背景技術

GenBank的核酸序列信息日益豐富，但報道的許多新基因僅獲取了部分DNA序列。當我們不了解某個基因完整的DNA序列時，就無法深入研究該基因的結構和功能，因此需要從基因的部分已知DNA序列來確定其完整的序列，由于現行的方法極其有限，從而使這項工作變得繁重和棘手。隨機測序法是通過大量的隨機測定DNA序列，并借助計算機進行排序的方法來獲取所需要的DNA序列。該方法存在很大的偶然性，通常會耗費很大的人力和物力。3′-和5′-RACE(3′and?5′Rapid?Amplification?of?cDNA?Ends)法是在已知部分mRNA序列的情況下，獲取目的基因完整的mRNA序列。RACE法只能獲取基因的可轉錄部分，而不能確定基因的上下游調控元件序列。另外，RACE法步驟較繁瑣，mRNA又極其不穩定，反轉錄還特別容易受到豐度低和高級結構的影響，因此效果也不是很理想。而利用同位素或生物素標記探針對基因組文庫進行雜交篩選的方法，則更是費時費力，是研究者在不得已的情況下的最后選擇。

發明內容

本發明的目的是提供一種操作簡便、應用范圍廣、成本低廉、高效準確、pUCm-T載體介導的PCR擴增方法，能夠基于已知DNA序列確定其5′端側翼未知DNA序列。

本發明的技術方案：①選用限制性內切酶雙酶切基因組DNA；②純化的酶切產物用Taq酶或Ex?Taq酶進行補齊和3′端加A(Adenine)反應，與pUCm-T載體連接；③利用引物設計軟件選定T載體上的一段特異性序列作為5′端引物、兩條靠近未知序列端的已知DNA序列上的互補序列作為3′端引物；④以pUCm-T載體連接物為模板，用設計的引物進行二輪的PCR(巢式PCR)擴增，并對其擴增片段進行克隆和測序。具體步驟如下：

(1)PCR引物的設計：根據已知DNA序列設計兩條3′端特異性引物，命名為Primer-R1和Primer-R2(18-22bp)；Primer-R2的3′端距待測序列要保留30bp以上長度，比Primer-R1接近待測的未知序列(圖1和圖4)；針對本發明引入的pUCm-T載體，在其T/A克隆位點的?上游選定一條5′端特異性引物(21bp，Tm值60℃)，命名為T-PrimerF(圖2和圖5)。

(2)限制性內切酶的選擇：分析已知DNA序列上的限制性內切酶位點，選用從Primer-R1到待測的未知序列之間沒有酶切位點的兩種限制性內切酶。本發明可供選擇常用的產生5′粘性末端的內切酶有EcoRⅠ、HindⅢ、BglⅡ、SalⅠ、BamHⅠ、NcoⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等；產生平齊末端的有EcoRⅤ、SnaBⅠ和ScaⅠ等；產生3′粘性末端的有BmtⅠ、PstⅠ、SacⅠ和KpnⅠ等。

(3)PCR模板的構建：運用步驟(2)選擇的兩種內切酶對基因組DNA進行雙酶切，純化的酶切產物用Taq酶或Ex?Taq酶進行補齊和3′端加A反應，與pUCm-T載體連接，即可作為PCR模板。此步驟若選用的兩種內切酶都是5′粘性或平齊末端，只需選用普通Taq酶；否則需要選用帶有3′→5′外切酶活性的Ex?Taq酶。

(4)巢式PCR擴增：以步驟(3)的T載體連接物為模板，用T-PrimerF和Primer-R1為引物進行第一輪PCR擴增；再以首輪PCR擴增產物為模板，用T-PrimerF和Primer-R2為引物進行第二輪PCR擴增。將兩輪PCR(巢式PCR)擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據巢式PCR原理可以快速驗證其擴增的產物是否為目的片段。

本發明的優點：

本發明使用特異性引物進行巢式PCR擴增，可以確定出已知DNA序列5′端側翼的未知序列。它與現行的方法相比，具有如下的優點：

1、操作簡便。與隨機測序法相比，避免了對基因組進行大規模的測序，也無需進行繁瑣的計算和排序工作，從而節省了大量的人力、時間和財力。

2、應用范圍廣。在已知部分DNA序列的基礎上，pUCm-T載體介導的PCR擴增可應用于各種不同基因的5′端側翼未知序列的測定。

3、操作限制少。只要有90bp左右的已知DNA序列就足夠操作，而且可供選擇的限制性內切酶較多。