[發明專利]一種T載體介導的測定5′端側翼未知序列的方法

無效

• 申請號: 201010550843.0
• 申請日: 2010-11-19
• 公開（公告）號: CN102140500A
• 公開（公告）日: 2011-08-03
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;唐存多;高金湖;譚中標;李劍芳;陳偉;張慧敏
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種pUCm-T載體介導的PCR擴增已知DNA序列5′端側翼未知序列的方法，其特征在于：選用限制性內切酶酶切基因組DNA；純化的酶切產物用Taq酶或Ex?Taq酶補齊和3′端加A，與pUCm-T連接；利用引物設計軟件選定T載體T/A克隆位點上游的一段序列作為5′端引物、兩條靠近未知序列端的已知DNA序列上的互補序列作為3′端引物；以pUCm-T連接物為模板，用設計的引物進行巢式PCR擴增以獲取已知DNA序列5′端側翼的未知序列；

(1)PCR引物的設計：基于已知DNA序列設計兩條3′端特異性引物，命名為Primer-R1和Primer-R2(18-22bp)；Primer-R2的3′端距待測序列要保留30bp以上長度，它比Primer-R1接近待測的未知序列；針對本發明引入的pUCm-T載體，在其T/A克隆位點的上游選定一條5′端特異性引物，命名為T-PrimerF(21bp，Tm值60℃)；

(2)限制性內切酶的選擇：根據對已知DNA序列上限制性內切酶位點的分析，選用從Primer-R1到待測的未知序列之間沒有酶切位點的兩種內切酶；本發明可供選擇的常用的產生5′粘性末端的限制性內切酶有EcoRⅠ、HindⅢ、BglⅡ、SalⅠ、BamHⅠ、NcoⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等；產生平齊末端的有EcoRⅤ、SnaBⅠ和ScaⅠ等；產生3′粘性末端的有BmtⅠ、PstⅠ、SacⅠ和KpnⅠ等；

(3)PCR模板的構建：運用步驟(2)選擇的兩種內切酶對基因組DNA進行酶切，純化的酶切產物用Taq酶或Ex?Taq酶進行補齊和3′端加A反應，與pUCm-T載體連接，即可作為PCR模板；此步驟若選用的兩種內切酶都是5′粘性或平齊末端，只需選用普通Taq酶，否則需要選用帶有3′→5′外切酶活性的Ex?Taq酶；

(4)巢式PCR擴增：以步驟(3)的T載體連接物為模板，采用T-PrimerF和Primer-R1為引物進行第一輪PCR擴增；再以首輪PCR擴增產物為模板，采用T-PrimerF和Primer-R2為引物進行第二輪PCR擴增；將兩輪PCR(巢式PCR)擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據巢式PCR原理可以快速驗證其擴增的產物是否為目的片段。

2.根據權利要求1所述的方法，操作過程中所使用的反應體系和條件如下：

(1)按如下的體系和條件雙酶切宇佐美曲霉E001基因組DNA(以HindⅢ和XbaⅠ為代表)：10×M?Buffer?2μl，HindⅢ?1μl，XbaⅠ?1μl，基因組DNA?10μl，無菌水6μl；將該體系在37℃水浴中反應4h；純化回收雙酶切產物并溶于20μl無菌水中；

(2)按如下的體系和條件對酶切產物進行補齊和3′端加A(以宇佐美曲霉E001的cel12A基因為代表)：酶切產物20μl，10×PCR?Buffer?2.5μl，dNTP?0.5μl，Taq酶0.25μl，無菌水1.75μl；72℃反應10min；目的產物命名為cel12AP；

(3)按如下的體系和條件連接cel12AP與pUCm-T：50％?PEG4000?1μl，10×T4?DNA?Ligase?Buffer?1μl，pUCm-T載體1μl，T4?DNA?Ligase?1μl，cel12AP?6μl；16℃連接過夜；目的產物命名為pUCm-T-cel12AP；

(4)按如下的PCR體系和條件進行第一輪的PCR擴增：10×PCR?Buffer?5μl，dNTP?3μl，pUCm-T-cel12AP?5μl，T-PrimerF?1μl，Cel12A-R1?1μl，無菌水34.5μl，Taq酶0.5μl；94℃?4min，30個循環(94℃?30s，55℃?30s，72℃?1min)，72℃?10min；首輪PCR產物命名為cel12AP-Out；按如下的體系和條件進行第二輪的PCR擴增：10×PCR?Buffer?5μl，dNTP?3μl，cel12AP-Out?1μl，T-PrimerF?1μl，Cel12A-R21μl，無菌水38.5μl，Taq酶0.5μl；94℃?4min，30個循環(94℃?30s，55℃?30s，72℃?1min)，72℃?10min；第二輪PCR產物命名為cel12AP-In。