[發明專利]一種溶菌酶及其制備和應用

無效

• 申請號: 201010544907.6
• 申請日: 2010-11-05
• 公開（公告）號: CN102061291A
• 公開（公告）日: 2011-05-18
• 發明（設計）人: 孫黎;趙璐
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12N9/36
• 分類號: C12N9/36;C12N1/16;A61K38/47;A61P31/02;A61P31/04;A61P31/10;A01N47/44;A01P1/00
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 許宗富;周秀梅

技術領域

本發明涉及分子微生物學領域，具體的說是一種溶菌酶(lysozyme)及其制備和應用。

背景技術

溶菌酶(EC?3.2.1.17)，又名胞壁質酶(muramidase)，是一種糖苷水解酶，能降解細菌細胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1，4糖苷鍵，從而破壞細胞壁，使得細菌由于滲透溶解而死亡。溶菌酶廣泛存在于各種生物中，包括人類、動物、植物、鳥類等。基于其抑菌效應，溶菌酶在多種生物中皆是重要的天然免疫因子，在抵抗細菌入侵過程中發揮作用。與其它抗菌因子相比，溶菌酶具有活性穩定、可以冷凍或干燥處理、抗菌譜廣等優點，因此，溶菌酶在醫學和食品工業中被用作抗感染物質和防腐劑。

發明內容

本發明目的在于提供一種溶菌酶及其制備和應用。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種溶菌酶：溶菌酶為序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸序列所示。

溶菌酶的制備：

1)質粒pLysG的構建：

以大菱鲆cDNA為模板，用引物F1和R1進行PCR擴增。PCR產物純化后與載體pBS-T于室溫連接2-8小時，連接混合液轉化大腸桿菌，篩選轉化子提取質粒，即為質粒pBLysG

將上述質粒pBLysG和質粒pPIC9H分別用限制性內切酶EcoRV和SnaBI酶切，回收0.58kb和9.2kb片段，將這二片段用T4DNA連接酶連接，連接液轉化入大腸桿菌，篩選轉化子提取質粒，即為質粒pLysG；

2)溶菌酶的表達和制備

將上述步驟1)的質粒pLysG轉化入酵母GS115內，在含有安卡青霉素的LB培養基上培養，篩選轉化子即為GS115/pLysG；

將轉化子GS115/pLysG進行誘導表達后，收集上清，將上清用UltraCentrifugal?Filter?Devices濃縮20-25倍后，濃縮后的上清即為序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸序列所示的溶菌酶。

所述步驟1)中F1為5’-GATATCATGGGTTATGCAAATATCAAGG-3’；R?1為5’-GATATCAAACCCATTCCTTTTGTACCA-3’。

溶菌酶的應用：所述序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸序列的溶菌酶可作為抑菌劑。

所述溶菌酶可作為革蘭氏陽性或革蘭氏陰性菌的抑菌劑。所述溶菌酶可作為哈氏弧菌、海豚鏈球菌、創傷弧菌或副溶血弧菌的抑菌劑。

本發明具有如下優點：

1.穩定表達。本發明的酵母表達系統可以穩定高效地表達溶菌酶。

2.廣譜、高效抑菌作用。本發明的溶菌酶可以有效裂解多種革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌，因而可以用于防控細菌性疾病。

附圖說明

圖1為本發明實施例純化得到的溶菌酶田永圖譜(其中，純化得到的溶菌酶為泳道2；泳道1：分子量marker。)。

圖2為本發明實施例溶菌酶的殺菌效應圖。(其中，圖A為本發明實施例溶菌酶產生的抑菌圈；圖B為PBS陰性對照)。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例旨在對本發明進行舉例描述，而非以任何形式對本發明進行限制。

在本發明實施例中所涉及到的常規性實驗方法均采用如下方法：

1.質粒提取、DNA(PCR)產物純化、DNA片段從凝膠中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相應試劑盒。

2.大腸桿菌用Hanahan方法(Sambrook?and?Russell：MolecularCloning：A?Laboratory?Mannual.Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press2001)；酵母轉化按Invitrogen公司的方法(Catalog?no.V175-20)；聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)按照Sambrook?and?Russell：Molecular?Cloning：A?Laboratory?Mannual.Cold?Spring?HarborLaboratory?Press?2001。

3.所有限制性內切酶和連接酶皆購自于“紐英倫生物技術有限公司”，北京。

實施例1

本發明的溶菌酶為序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸序列。

序列表SEQ?ID?No.1為：