[發明專利]高效表達類胰島素生長因子IGF-1的乳腺特異性表達載體

無效

• 申請號: 201010544656.1
• 申請日: 2010-11-16
• 公開（公告）號: CN102041271A
• 公開（公告）日: 2011-05-04
• 發明（設計）人: 楊倩;林建;庾慶華;張強
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/12;C12N15/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一、技術領域

本發明涉及一種高效表達類胰島素生長因子的乳腺特異性表達載體，屬于生物技術領域，具體地講涉及促進泌乳、提高奶產量的類胰島素生長因子IGF-1。

二、背景技術

羊奶營養豐富，是最“接近完美的食品”；人稱“白色血液”，是最理想的天然食品。但每頭羊單產量比較低，且羊奶所占的市場份額不足5％，于是提高羊奶產量就成為一個急需完成的任務擺在了我們面前。常規的育種技術費時，費力；而轉基因技術正好可以快速改變物種某種性狀。體內影響乳腺發育的主要因素有生長激素、催乳素、孕酮、雌激素和類胰島素生長因子(IGF-1)。其中IGF-1在泌乳期奶羊乳腺發育中起到重要作用，IGF-1的缺少將直接導致乳腺的不發育。

IGF-1功是一類介導合成代謝且具有GH樣效應的細胞因子，IGF-1也被稱作“促生長因子”(即somatomedin?C)，是一種在分子結構上與胰島素類似的多肽蛋白物質。IGF-1對泌乳的影響主要體現在兩個方面：一方面，它可以提高泌乳動物單位時間的奶產量。Prosser通過對泌乳期的山羊動脈注射IGF-1，可以使山羊的奶產量提高9％；另一方面，IGF-1還可以提高泌乳動物的泌乳持續性。Hdsell研究表明，IGF-1的持續表達使乳腺上皮細胞不進入凋亡途徑，減緩乳腺細胞的衰老，從而延長了泌乳的時間以及泌乳的分泌能力。IGF-1對乳腺的泌乳起著重要作用的其機制可能是通過調節信號分子來促進乳腺細胞Akt(Rac蘇氨酸激酶)活性同時提高泌乳動物的泌乳持續性；也可能是通過改善氧化破壞的效應來提高泌乳動物泌乳的持續性；還有可能是IGF-1使乳腺上皮細胞不進入凋亡途徑，減緩乳腺細胞的衰老，從而延長了泌乳的時間以及泌乳的分泌能力。Loladze等發現在產后乳腺的發育對上皮細胞和皮間質中IGF-1的表達具有依賴性。具體來說：上皮細胞的IGF-1在青春期介導分支導管的正常發育；而皮間質IGF-1則在青春期和腺泡形成期調節上皮細胞的擴散和成熟。此外，IGF-1對腺泡中乳蛋白的翻譯也起到一定的調節作用。Forsyth在羊中發現IGF-1mRNA的表達量在青春期和妊娠期顯著高于其它時期。Su證明在轉IGF-1基因小鼠中，過表達IGF-1會刺激泌乳初期奶產量的增加。眾多研究都指向了IGF-1在乳腺發育中不可或缺的作用和對奶產量提高的潛在應用價值。應用乳腺特異性啟動子(如酪蛋白、乳清蛋白和乳白蛋白)構建IGF-1乳腺特異性表達載體，可在泌乳初期增加轉IGF-1基因小鼠的奶產量。

本研究從薩能奶山羊中克隆得到一個與乳腺發育和泌乳持續性相關的基因igf-1，通過構建乳腺特異性表達載體pIN，研究IGF-1基因在體外人乳腺癌細胞Bcap-37上的表達情況，為進一步生產轉IGF-1基因奶山羊提供試驗材料。

三、發明內容

技術問題

本發明的目的在于公開一個薩能奶山羊類胰島素生長因子基因igf-1促進泌乳的基因工程應用，構建乳腺特異性表達載體pIN，并在人乳腺癌細胞Bcap-37上通過轉染后檢測IGF-1的表達量，證實載體的有效性，為后期生產轉igf-1基因奶山羊提供試驗材料。

技術方案

高效表達類胰島素生長因子(IGF-1)的乳腺特異性表達載體pIN，其中igf-1基因具有如SEQ?ID?NO.1所示的序列。其構建方法包括：

1)薩能奶山羊類胰島素生長因子基因igf-1的克隆

參照NCBI上genebank登錄號：D11378的山羊IGF-1mRNA全序列引物設計如下：

上游引物：5’-ACAGGTACCATGGGAAAAATCAGCAGTCT-3’

下游引物：5’-CGCAAGCTTCTACATTCTGTAGTTCTTGT-3’

以薩能奶山羊肝臟組織提取的總RNA為模板，經M-MLV反轉錄酶合成cDNA第一鏈后進行PCR擴增；反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，57℃復性30s，72℃延伸45s，30個循環后；72℃延伸10min；將PCR克隆至pMD19-T載體，測序后獲得具有完整編碼區的薩能奶山羊類胰島素生長因子基因igf-1的cDNA序列SEQID?NO.1；

2)乳腺特異性表達載體的構建

根據骨架載體pBC1和SEQ?ID?NO.1序列，設計特異性引物：

上游引物：5’-ATCGCGGATCCTCGAGATGGGAAAAATCAG-3’

下游引物：5’-GGTCCGGATCCTCGAGGAGCTCCTACATTCTGTAG-3’