[發(fā)明專利]一種陽離子聚合物及其制備方法和用途

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010540909.8
• 申請(qǐng)日: 2010-11-11
• 公開（公告）號(hào): CN102464801A
• 公開（公告）日: 2012-05-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高瑜;李亞平;張志文;顧王文
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院上海藥物研究所
• 主分類號(hào): C08G73/08
• 分類號(hào): C08G73/08;C12N15/63;C12N15/65
• 代理公司: 北京金信立方知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11225
• 代理人: 朱梅;魯云博

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種新型陽離子聚合物及其制備方法和用途，還涉及由該新型陽離子聚合物與核酸構(gòu)成的納米復(fù)合物及其制備方法和用途。

背景技術(shù)

基因治療是指將正常基因或有治療作用的基因通過一定的方式導(dǎo)入靶細(xì)胞以糾正基因缺陷或發(fā)揮治療作用，確切地說，它是遺傳信息相關(guān)的特異性核酸序列的轉(zhuǎn)移，是一項(xiàng)綜合性高難度的生物技術(shù)。因此，基因治療的關(guān)鍵問題就是尋找高效、低毒的基因載體。迄今研究開發(fā)的基因載體主要有病毒載體和非病毒載體兩大類，其中，病毒載體，如各種逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、皰疹病毒、腺相關(guān)病毒等，雖然轉(zhuǎn)染效率高，但存在著對(duì)外源基因的容納量少(約4.5-30kbp)、穩(wěn)定性差、免疫原性高、毒性大、靶向特異性差等諸多缺點(diǎn)；而非病毒載體由于容易大規(guī)模制備、成本低、對(duì)外源基因無大小限制、具有低免疫原性和相對(duì)安全等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的高度重視，并被建議替代病毒載體而成為基因載體研究的主要方向。

在非病毒載體研究中，陽離子聚合物基因輸送系統(tǒng)已成為基因非病毒載體設(shè)計(jì)開發(fā)的主要方向，例如，對(duì)多聚賴氨酸(PLL)、聚乙烯亞胺(PEI)、聚酰胺-胺型樹枝狀高分子、聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯、殼聚糖和聚陽離子環(huán)糊精等。遺憾的是，迄今為止研究發(fā)現(xiàn)的陽離子聚合物基因輸送載體的轉(zhuǎn)染效率都不理想或轉(zhuǎn)染效率較高但由于體內(nèi)不降解導(dǎo)致毒性太大。因此，尋找新型的高效、低毒的基因非病毒載體已成為基因治療研究領(lǐng)域最為迫切并具挑戰(zhàn)性的課題之一。

帶有高正電荷密度的陽離子聚合物可有效壓縮DNA形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物，使DNA能被細(xì)胞有效攝取并保護(hù)DNA在輸送過程中免受酶的降解。但高電荷密度的聚合物，特別是不可降解的聚合物，會(huì)對(duì)細(xì)胞造成極大的毒性。此外，當(dāng)納米復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞后，DNA必須要從復(fù)合物中有效解離才能發(fā)揮作用，因此過緊的壓縮DNA會(huì)導(dǎo)致DNA無法從復(fù)合物中解離而使轉(zhuǎn)染失敗。因此，如何克服聚合物的毒性和轉(zhuǎn)染效率之間以及細(xì)胞外DNA的強(qiáng)壓縮效果和細(xì)胞內(nèi)DNA的有效解離之間的雙重矛盾已成為陽離子非病毒基因輸送過程中的難題。

二硫鍵即S-S鍵，是由蛋白質(zhì)的兩個(gè)半胱氨酸之間配對(duì)形成的一種共價(jià)鍵。在細(xì)胞中，二硫鍵可被谷胱甘肽降解。因此，利用細(xì)胞內(nèi)外谷胱甘肽(GSH)濃度差高達(dá)三個(gè)數(shù)量級(jí)且谷胱甘肽可降解二硫鍵的特性，可將二硫鍵引入到陽離子聚合物內(nèi)部合成還原響應(yīng)性的聚合物，該聚合物可在細(xì)胞外有效壓縮DNA成足夠小的納米復(fù)合物利于細(xì)胞攝取，并保持DNA在輸送過程中穩(wěn)定。當(dāng)納米復(fù)合物通過內(nèi)吞機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)高GSH作用下，二硫鍵斷裂，DNA可有效從復(fù)合物中解離。此外，在聚合物中引入二硫鍵可提高聚合物的降解性，進(jìn)一步降低聚合物的毒性。

最近幾年，產(chǎn)生了一種新的聚合物合成方法，即Huisgen環(huán)加成反應(yīng)或“Click”反應(yīng)。Click反應(yīng)就是將末端帶有炔基和疊氮基團(tuán)的單體通過高選擇性環(huán)合耦聯(lián)后形成帶有三唑環(huán)結(jié)構(gòu)的聚合物，其最早是由Sharpless于2001年提出的。此后，Click反應(yīng)就被廣泛用于合成各種材料。有大量研究表明，雜環(huán)和酰胺毗鄰的結(jié)構(gòu)能與核酸特異性地穩(wěn)定結(jié)合在一起。因此，利用三唑和酰胺鍵毗鄰的結(jié)構(gòu)可特異性結(jié)合DNA以及二硫鍵的還原響應(yīng)性，通過合理的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，通過Click反應(yīng)可合成出既帶有三唑和酰胺毗鄰的結(jié)構(gòu)又帶有二硫鍵的結(jié)構(gòu)的聚合物，這樣，既能提高納米復(fù)合物的胞外穩(wěn)定性和增強(qiáng)DNA的胞內(nèi)解離效果，又能增加聚合物降解性、降低聚合物毒性。

發(fā)明內(nèi)容

基于上述研究背景，本發(fā)明人以一縮二乙二醇、三乙烯四胺和3，3’-二硫代二丙酸為原料，通過Click反應(yīng)合成一種具有全新結(jié)構(gòu)的陽離子聚合物。此聚合物含有的仲胺基團(tuán)帶有正電荷，能有效壓縮核酸，同時(shí)能在酸性條件下接受H+，具有類似PEI的“質(zhì)子海綿”效應(yīng)；而且該聚合物中含有醚氧基結(jié)構(gòu)，這就使該聚合物具有一定的親水性和柔軟性，具有類似PEG的性質(zhì)，能在一定程度上分散聚合物的正電荷，阻止陽離子聚合物/核酸納米復(fù)合物的聚集，減少聚合物對(duì)細(xì)胞的刺激性；該聚合物中含有的三唑和酰胺鍵毗鄰的結(jié)構(gòu)與DNA有很強(qiáng)的結(jié)合能力，可阻止納米復(fù)合物聚集，提高納米粒在輸送過程中的穩(wěn)定性；并且該聚合物中含有二硫鍵可提高DNA在胞內(nèi)的解離效率，提高基因轉(zhuǎn)染效率，此外，二硫鍵可在胞內(nèi)降解，大大提高了聚合物的降解性，降低聚合物的毒性。

因此，本發(fā)明的目的在于提供一種高效低毒的用作非病毒型基因載體的新型還原響應(yīng)性陽離子聚合物及其制備方法和用途。本發(fā)明的另一目的在于提供使用該陽離子聚合物制備的陽離子聚合物/核酸納米復(fù)合物及其制備方法和用途。