[發(fā)明專利]一種無抗生素抗性標(biāo)記的枯草芽孢桿菌構(gòu)建方法及篩選靶基因失活的枯草芽孢桿菌的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010535809.6
• 申請(qǐng)日: 2010-11-09
• 公開（公告）號(hào): CN102021164A
• 公開（公告）日: 2011-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陸兆新;張充;別小妹;呂鳳霞;王煜;趙海珍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/09
• 分類號(hào): C12N15/09;C12N15/10;C12N15/63;C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種無抗生素抗性標(biāo)記的枯草芽孢桿菌構(gòu)建方法及篩選靶基因失活的枯草芽孢桿菌的方法。

背景技術(shù)

枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)被公認(rèn)為是安全菌株(GRAS)，可以使外源基因分泌表達(dá)出有活性的產(chǎn)物。此外，枯草芽孢桿菌遺傳背景清楚、具有生長迅速、培養(yǎng)條件簡單、良好的發(fā)酵基礎(chǔ)和生產(chǎn)技術(shù)，使其在科研和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。B.subtilis作為一種重要的工業(yè)微生物，具有開發(fā)為食品級(jí)表達(dá)宿主的優(yōu)勢(shì)，減少用于食品行業(yè)的重組生物制品的下游分離純化成本。

目前B.subtilis作為宿主的最大問題是其自身分泌的蛋白酶，對(duì)外源蛋白產(chǎn)生降解作用，嚴(yán)重的影響了外源目的產(chǎn)物的分泌表達(dá)產(chǎn)量。B.subtilis分泌多種蛋白酶對(duì)外源基因的降解作用早已引起許多學(xué)者的注意。國外學(xué)者通過基因敲出技術(shù)將已發(fā)現(xiàn)的蛋白酶基因逐個(gè)敲除，生成了DB104、DB403、WB600、WB700、WB800等蛋白酶缺陷菌株。WB800是由加拿大Sui-Lam?Wong教授實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)建的敲除了堿性蛋白酶(apr)、中性蛋白酶(npr)、金屬蛋白酶(mpr)、中性蛋白酶B(nprB)、三種絲氨酸蛋白酶(epr、bpf和vpr)和胞壁蛋白酶(cwp)8種蛋白酶的菌株。該菌株已失去絕大部分的蛋白酶活力，很多基因在該宿主內(nèi)實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定表達(dá)。但是WB800內(nèi)殘留的蛋白酶仍然對(duì)某些敏感蛋白造成降解。WB800的構(gòu)建也是通過傳統(tǒng)的基因敲出過程，宿主本身攜帶了多種抗生素基因，不能應(yīng)用于食品級(jí)工程菌，不符合食品安全標(biāo)準(zhǔn)。

傳統(tǒng)的對(duì)枯草芽孢桿菌染色體的基因操作是通過一個(gè)正向篩選標(biāo)記實(shí)現(xiàn)的，通常是在要失活或敲除的基因內(nèi)部插入一個(gè)抗性基因，其兩端即為同源交換臂，這樣根據(jù)同源重組原理，修飾過的或無活性的基因?qū)⒃既旧w上的活性基因置換。然而，當(dāng)我們?cè)诮?jīng)過一次基因修飾的菌株上再次進(jìn)行基因操作，不可避免的引入第二個(gè)抗性基因；另外一種方法是通過再一次的單交換作用，將第一次引入的抗性基因切除掉。可以想見第一種方法，將會(huì)導(dǎo)致宿主產(chǎn)生多種抗生素抗性，而且多重抗生素抗性壓力下有可能會(huì)改變菌株的生理特性；第二種方法的缺陷是發(fā)生一次雙交換后，再發(fā)生一次單交換的頻率極低，而且沒有正向篩選標(biāo)記，工作量相當(dāng)大。

因此，建立一套枯草芽孢桿菌的無抗生素抗性標(biāo)記基因的篩選技術(shù)對(duì)基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究具有重要推動(dòng)作用。Fabret等在2002年第一次報(bào)導(dǎo)了枯草芽孢桿菌無標(biāo)記基因組修飾的方法，原理是通過控制尿嘧啶合成的有無來起到篩選的目的。此后，先后出現(xiàn)了5篇這方面的報(bào)導(dǎo)，或是以利用抗藥性篩選、利用營養(yǎng)缺陷型篩選和利用毒素基因/解毒素基因篩選。這些方法的共同之處是需要發(fā)生兩次雙交換過程達(dá)到基因修飾的目的。第一次雙交換借助同源片段，第二次雙交換借助所修飾的靶基因位點(diǎn)兩側(cè)引入的兩個(gè)同向重復(fù)序列(DR)。雖然上述方法能夠達(dá)到無抗生素抗性標(biāo)記篩選的目的，但是構(gòu)建敲除載體過程繁瑣，并且重組突變效率低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種無抗生素抗性標(biāo)記的枯草芽孢桿菌構(gòu)建方法及篩選靶基因失活的枯草芽孢桿菌的方法。

一種無抗生素抗性標(biāo)記的條件賴氨酸營養(yǎng)缺陷型枯草芽孢桿菌構(gòu)建方法，其特征在于包括下述步驟：

(1)分別構(gòu)建SpovAF-CM-Lys和SpovAF-Pspac-Lys同源交換片段；

(2)SpovAF-CM-Lys轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168感受態(tài)細(xì)胞，發(fā)生一次雙交換，該菌株基因組上LysA基因天然啟動(dòng)子被置換為含有終止子的CM基因，得到賴氨酸營養(yǎng)缺陷型突變菌株BS-CM；

(3)SpovAF-Pspac-Lys轉(zhuǎn)化BS-CM感受態(tài)細(xì)胞，發(fā)生一次雙交換，所述的CM基因被替換為受LacI基因抑制調(diào)節(jié)的Pspac啟動(dòng)子，得到無抗生素抗性標(biāo)記的條件賴氨酸營養(yǎng)缺陷型枯草芽孢桿菌BS-PS。

其中，所述的SpovAF-CM-Lys同源交換片段通過如下步驟得到：

(1)以枯草芽孢桿菌168基因組DNA為模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到spoVAF基因和Lys基因，以pJC164.3質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增包括啟動(dòng)子和終止子的CM基因，將這三個(gè)基因分別克隆至pMD19-T載體，得到pMD19-T-spoVAF、pMD19-T-LysA、pMD19-T-CM載體；

(2)步驟(1)所述的pMD19-T-CM經(jīng)雙酶切后獲得CM片段，與經(jīng)過相同雙酶切處理的pMD?19-T-spoVAF載體連接得到pMD?19-T-spoVAF-CM載體；