[發明專利]一種無抗生素抗性標記的枯草芽孢桿菌構建方法及篩選靶基因失活的枯草芽孢桿菌的方法

無效

• 申請號: 201010535809.6
• 申請日: 2010-11-09
• 公開（公告）號: CN102021164A
• 公開（公告）日: 2011-04-20
• 發明（設計）人: 陸兆新;張充;別小妹;呂鳳霞;王煜;趙海珍
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/10;C12N15/63;C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤

1.一種無抗生素抗性標記的條件賴氨酸營養缺陷型枯草芽孢桿菌構建方法，其特征在于包括下述步驟：

(1)分別構建SpovAF-CM-Lys和SpovAF-Pspac-Lys同源交換片段；

(2)利用所述的SpovAF-CM-Lys轉化枯草芽孢桿菌168感受態細胞，發生一次雙交換，該菌株基因組上LysA基因天然啟動子被置換為含有終止子的CM基因，得到賴氨酸營養缺陷型突變菌株BS-CM；

(3)利用所述的SpovAF-Pspac-Lys轉化BS-CM感受態細胞，發生一次雙交換，所述的CM基因被替換為受LacI基因抑制調節的Pspac啟動子，得到無抗生素抗性標記的條件賴氨酸營養缺陷型枯草芽孢桿菌BS-PS。

2.根據權利要求1所述的無抗生素抗性標記的條件賴氨酸營養缺陷型枯草芽孢桿菌構建方法，其特征在于所述的SpovAF-CM-Lys同源交換片段通過如下步驟得到：

(1)以枯草芽孢桿菌168基因組DNA為模板分別進行PCR擴增得到spoVAF基因和Lys基因，以pJC164.3質粒為模板PCR擴增包括啟動子和終止子的CM基因，將這三個基因分別克隆至pMD19-T載體，得到pMD19-T-spoVAF、pMD19-T-LysA、pMD19-T-CM載體；

(2)步驟(1)所述的pMD19-T-CM經雙酶切后獲得CM片段，與經過相同雙酶切處理的pMD?19-T-spoVAF載體連接得到pMD?19-T-spoVAF-CM載體；

(3)步驟(1)所述的pMD19-T-LysA經雙酶切后獲得LysA片段，與經過相同雙酶切處理的pMD19-T-spoVAF-CM載體連接得到pMD19-T-S-C-L載體；

(4)以spoVAF-F(SEQ?ID?NO.1)為上游引物，LysA-R(SEQ?ID?NO.4)為下游引物，以步驟(3)所述pMD19-T-S-C-L載體為模板PCR擴增得到SpovAF-CM-LysA同源交換片段。???

3.根據權利要求1所述的無抗生素抗性標記的條件賴氨酸營養缺陷型枯草芽孢桿菌構建方法，其特征在于所述的SpovAF-Pspac-LysA同源交換片段通過如下步驟得到：

(1)以枯草芽孢桿菌168基因組DNA為模板分別進行PCR擴增得到spoVAF基因和Lys基因，以PDG-Stu質粒為模板PCR擴增得到Pspac啟動子基因，將這三個基因分別克隆至pMD19-T載體，得到pMD19-T-spoVAF、pMD19-T-LysA、pMD19-T-Pspac載體；

(2)步驟(1)所述的pMD19-T-Pspac經雙酶切后獲得Pspac片段，與經過相同雙酶切處理的pMD?19-T-spoVAF載體連接得到pMD?19-T-spoVAF-Pspac載體；

(3)步驟(1)所述的pMD19-T-LysA經雙酶切后獲得LysA片段，與經過相同雙酶切處理的pMD19-T-spoVAF-Pspac載體連接得到pMD19-T-S-P-L載體；

(4)以spoVAF-F(SEQ?ID?NO.1)為上游引物，LysA-R(SEQ?ID?NO.4)為下游引物，以步驟(3)所述pMD19-T-S-P-L載體為模板PCR擴增得到SpovAF-Pspac-LysA同源交換片段。

4.一種利用無抗生素抗性標記基因篩選技術篩選靶基因失活的枯草芽孢桿菌的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)按照權利要求1所述方法構建無抗生素抗性標記的條件賴氨酸營養缺陷型枯草芽孢桿菌BS-PS；

(2)構建插入失活靶基因的同源整合載體；

(3)將步驟(2)所述的同源整合載體轉化步驟(1)所述的無抗生素抗性標記的條件賴氨酸營養缺陷型枯草芽孢桿菌BS-PS，通過一次單交換和一次由于基因組結構不穩定引起的自發單交換過程，以是否能自我合成賴氨酸為篩選標記，得到兩種基因型的枯草芽孢桿菌突變株，一種為枯草芽孢桿菌回復突變菌株，另一種為靶基因失活的無抗生素抗性標記基因的枯草芽孢桿菌突變株，經PCR鑒定篩選得到靶基因失活的無抗生素抗性標記基因的枯草芽孢桿菌突變株。