[發明專利]一種提高L-苯丙氨酸基因工程菌產酸率的方法

無效

• 申請號: 201010534676.0
• 申請日: 2010-11-05
• 公開（公告）號: CN102041284A
• 公開（公告）日: 2011-05-04
• 發明（設計）人: 黃欽耿;吳偉斌;蔡愛金;施巧琴;施碧紅;黃祥峰;陳炳生;吳松剛
• 申請（專利權）人: 福建省麥丹生物集團有限公司
• 主分類號: C12P13/22
• 分類號: C12P13/22;C12N1/21;C12N15/09;C12R1/19
• 代理公司: 福州市鼓樓區京華專利事務所(普通合伙) 35212
• 代理人: 翁素華

【技術領域】

本發明涉及生物工程領域，具體涉及一種通過PCR技術改造工程質粒且對改造后質粒的宿主菌采用Red系統進行介導來提高L-苯丙氨酸產酸率的方法。

【背景技術】

L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)簡稱L-Phe，為白色結晶粉末，是人體和動物不能在體內自行合成的必須的氨基酸之一，廣泛應用于食品、飼料、醫藥和化妝品等領域，尤其是低熱量、高甜度的二肽甜味劑阿斯巴甜(Aspartame)應用日益廣泛，作為合成阿斯巴甜兩種原料之一的L-苯丙氨酸的市場需求量迅速增加。另外L-苯丙氨酸也是抗腫瘤藥物和氨基酸輸液制劑的必需原料，隨著其在醫藥領域的不斷開發，需求量也不斷增加。因此，對L-苯丙氨酸生物合成途徑的研究、L-苯丙氨酸產生菌的改良和對其工業化生產的研究越來越受到人們的重視。

國內外L-Phe的生產方法主要有水解抽提法、化學合成法、酶法和發酵法等。由于天然蛋白中L-苯丙氨酸含量較低，水解抽提法很少使用；化學合成法的工藝復雜，成本較高，在國外基本上被酶法和發酵法取代。但由于底物和酶的價格較高且來源有限，酶法應用也受到限制；由于微生物直接發酵法可利用廉價易得的原料，又可在常溫常壓下進行，是目前國內外生產L-Phe的主流方法，具有較大的競爭優勢。其中大腸桿菌以其繁殖迅速、培養簡單、操作方便、遺傳背景清楚等特點被廣泛改造為適應于外源基因表達的安全的基因工程受體生物。但是由于L-Phe等終產物對野生菌株體內的芳香族氨基酸合成代謝途徑上的關鍵酶有著強烈的反饋抑制作用，使其細胞不能大量蓄積苯丙氨酸。同時，多條競爭支路也相對分流了L-Phe的能量流向，從而使得L-Phe的收率有限。因此若要進行實際發酵生產，就必須改造野生菌株，解除支路代謝調控，使其目的代謝終產物能過量蓄積。

傳統的菌株選育是從自然界中高通量篩選產酸能強的菌株，但是該方法獲得的氨基酸種類和產量有限，后來在確立突變技術和闡明氨基酸合成系統調節機制的基礎上發展為營養缺陷變異株的選育。利用常規誘變育種的方法，其盲目性大，工作量繁重，而且不能增加基因的拷貝數量，且突變株一般都攜帶多種營養缺陷，使進一步提高產量受到限制。

近年來，隨著分子生物學研究的不斷深入，有機體越來越多的生物合成途徑被人們所認識，一些微生物基因組全序列的測定及多基因之間的協同作用和代謝網絡的多方面性研究、代謝工程和生物信息學研究的興起，基因、宿主有機體、載體系統和分子生物學工具的發展，通過代謝途徑的修飾不僅可以提高細胞己有的化學物質產量或產生宿主細胞本身不能合成的新物質，而且可以擴展細胞的底物使用范圍，提高一些有重要經濟價值的初級代謝產物和次生代謝產物。其中此類方法中以提高氨基酸的產量最具有成功的典范。

大腸桿菌直接發酵法合成L-苯丙氨酸，生物合成途徑分為共同途徑和分支途徑，共同途徑為分支途徑提供前體物質。以葡萄糖為起始物經赤蘚糖-4-磷酸(Erythrose-4-phosphate，E4P，五碳糖磷酸途徑的中間產物)和糖酵解過程的中間產物——磷酸烯醇式丙酮酸(Phophoenol?pyruvate，PEP)二者縮合形成一個七碳酮糖開鏈磷酸化合物，稱為3-脫氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(3-deoxy-α-arobinoheptulosonate-7-phosphate，DAHP)。這是芳香族氨基酸生物合成的共同代謝途徑，也是決定其產率和產量的關鍵步驟。因此，在大腸桿菌L-苯丙氨酸生物合成中，DAHP是L-苯丙氨酸生物合成過程中第一個也是最重要的代謝中間物，能否把中心代謝流有效地導向DAHP的合成是決定芳L-苯丙氨酸生物合成產量高低的決定因素。催化這一關鍵反應的酶稱之為脫氧阿拉伯糖型庚酮糖磷酸合酶(DS)，是分別由aroF、aroG和aroH三個基因編碼的三個同功酶，分別受酩氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的反饋抑制，同時DAHP合成酶還受到苯丙氨酸和酪氨酸的協同抑制。

共同途徑之后，分支酸是芳香族氨基酸合成途徑的分支點，在分支酸以后又分為兩條途徑，其中一條形成苯丙氨酸和酪氨酸，另一條形成色氨酸。

分支酸在分支酸變位酶作用下，轉變為預苯酸，經脫水、脫梭后形成苯丙酮酸，后者在轉氨酶作用下，與谷氨酸進行轉氨形成苯丙氨酸。分支酸途徑是人們較早對L-苯丙氨酸改良進行遺傳操作的重要環節。分支酸變位酶(CM)是與預苯酸脫水酶(PD)形成的雙功能酶，其活性態是兩個pheA基因編碼的大小為43000D的亞基構成的同源二聚體；CM/PD酶在Phe濃度較高時形成二聚體和四聚體的混合物，使酶活性降低或完全喪失，所以它受產物Phe的反饋抑制，Tyr對此酶也有協同抑制。