[發(fā)明專利]一種提高L-苯丙氨酸基因工程菌產(chǎn)酸率的方法無(wú)效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201010534676.0 | 申請(qǐng)日： | 2010-11-05 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN102041284A | 公開（公告）日： | 2011-05-04 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 黃欽耿;吳偉斌;蔡愛(ài)金;施巧琴;施碧紅;黃祥峰;陳炳生;吳松剛 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 福建省麥丹生物集團(tuán)有限公司 |
| 主分類號(hào)： | C12P13/22 | 分類號(hào)： | C12P13/22;C12N1/21;C12N15/09;C12R1/19 |
| 代理公司： | 福州市鼓樓區(qū)京華專利事務(wù)所(普通合伙) 35212 | 代理人： | 翁素華 |
| 地址： | 365500 福建省*** | 國(guó)省代碼： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 提高 苯丙氨酸 基因工程 菌產(chǎn)酸率 方法 | ||
1.一種提高L-苯丙氨酸基因工程菌產(chǎn)酸率的方法，其特征在于：采用PCR技術(shù)將L-苯丙氨酸的原始工程質(zhì)粒MDphe-2構(gòu)建成新一代工程質(zhì)粒MDphe-3；并通過(guò)Red系統(tǒng)對(duì)該工程質(zhì)粒MDphe-3的工程宿主菌的整體代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控基因csrA進(jìn)行缺失構(gòu)建；然后將工程質(zhì)粒MDphe-3植入整體代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控基因csrA缺失的工程宿主菌內(nèi)以構(gòu)建新的L-苯丙氨酸基因工程菌；最后對(duì)該新的L-苯丙氨酸基因工程菌的遺傳穩(wěn)定性及產(chǎn)酸進(jìn)行驗(yàn)證。
2.如權(quán)利要求1所述一種提高L-苯丙氨酸基因工程菌產(chǎn)酸率的方法，其特征在于：包括以下幾個(gè)步驟：
步驟一：將設(shè)計(jì)的帶有酶切位點(diǎn)的pckA基因采用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增；
步驟二：將步驟一擴(kuò)增后所獲得的pckA基因進(jìn)行電泳回收，并對(duì)回收的片段采用T-A克隆法克隆，且將連接后的陽(yáng)性克隆載體進(jìn)行連接方向篩選，以獲得PMDpckA載體；
步驟三：通過(guò)在PMDpckA載體中融合溫控啟動(dòng)子Pl序列及T7強(qiáng)終止子序列，最終獲得pckA基因的完整表達(dá)元件；
步驟四：將L-苯丙氨酸的原始工程質(zhì)粒MDphe-2進(jìn)行序列分析，接著在該工程質(zhì)粒MDphe-2的1293bp位點(diǎn)處進(jìn)行平末端化后再串聯(lián)插入平末端化后的pckA基因完整表達(dá)元件，以構(gòu)建新一代工程質(zhì)粒MDphe-3；
步驟五：采用Red系統(tǒng)的同源重組功能對(duì)工程質(zhì)粒MDphe-3的工程宿主菌整體代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控基因csrA進(jìn)行缺失；
步驟六：將工程質(zhì)粒MDphe-3植入csrA基因缺失的工程宿主菌當(dāng)中進(jìn)行表達(dá)，以完成新的L-苯丙氨酸基因工程菌的構(gòu)建；并對(duì)該新的L-苯丙氨酸基因工程菌的遺傳穩(wěn)定性及產(chǎn)酸進(jìn)行驗(yàn)證。
3.如權(quán)利要求2所述一種提高L-苯丙氨酸基因工程菌產(chǎn)酸率的方法，其特征在于：所述步驟三的具體操作如下：
取PMDpckA載體與PBV220質(zhì)粒通過(guò)酶切法構(gòu)建PBVpckA載體，之后取該P(yáng)BVpckA載體與pET28a質(zhì)粒通過(guò)酶切法構(gòu)建pETpckA28載體；然后將該pETpckA28載體作為模板，并設(shè)計(jì)一對(duì)融合PCR的引物；接著把該模板及引物混合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得完整的pckA基因表達(dá)元件，最后通過(guò)T-A克隆法及酶切法驗(yàn)證所獲得的pckA基因表達(dá)元件的完整性。
4.如權(quán)利要求2所述一種提高L-苯丙氨酸基因工程菌產(chǎn)酸率的方法，其特征在于：所述步驟四的具體操作如下：
(1)完整的pckA基因表達(dá)元件及L-苯丙氨酸的原始工程質(zhì)粒MDphe-2的預(yù)處理：
A.采用PCR技術(shù)對(duì)完整的pckA基因表達(dá)元件進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增過(guò)程以載體pETpckA28為模板，并利用融合PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增結(jié)束后用Dpn?I酶在37℃下處理1h，消化PCR擴(kuò)增的模板；最后對(duì)目的片段進(jìn)行電泳回收，回收片段即為平末端的完整的pckA基因表達(dá)元件；
B.將L-苯丙氨酸的原始工程質(zhì)粒MDphe-2進(jìn)行序列分析，并將該工程質(zhì)粒MDphe-2進(jìn)行單酶切消化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)其進(jìn)行電泳回收，以及平末端化處理，回收片段即為平末端缺口MDphe-2核苷酸片段；
(2)新一代工程質(zhì)粒MDphe-3的構(gòu)建：
A.將回收的完整的pckA基因表達(dá)元件的平末端及含平末端缺口的MDphe-2核苷酸片段采用連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，且該反應(yīng)于16℃下進(jìn)行并過(guò)夜，反應(yīng)結(jié)束后先在冰中放置15min后，取10μl直接轉(zhuǎn)化成感受態(tài)E.coliJM109細(xì)胞，并對(duì)該感受態(tài)E.coli?JM109細(xì)胞進(jìn)行LB+Kana抗性平板篩選，獲得陽(yáng)性克隆菌株；
B.取獲得的陽(yáng)性克隆菌株進(jìn)行質(zhì)粒抽提，并進(jìn)行Sty?I酶切驗(yàn)證，酶切結(jié)束后進(jìn)行電泳，電泳結(jié)果顯示除含完整的pckA基因表達(dá)元件的平末端片段外，同時(shí)還有另一質(zhì)粒片段，即為新一代工程質(zhì)粒MDphe-3。
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