[發明專利]6-磷酸葡萄糖脫氫酶和(S)-羰基還原酶偶聯提高(S)-苯基乙二醇轉化效率的方法

有效

• 申請號: 201010534231.2
• 申請日: 2010-11-08
• 公開（公告）號: CN101993828A
• 公開（公告）日: 2011-03-30
• 發明（設計）人: 張榮珍;徐巖;張波濤;耿亞維
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/53;C12N15/81;C12P41/00;C12P7/22;C12R1/84
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

6-磷酸葡萄糖脫氫酶和(S)-羰基還原酶偶聯提高(S)-苯基乙二醇轉化效率的方法，利用基因共表達提高全細胞不對稱轉化(S)-苯基乙二醇的效率和批次穩定性的方法，本發明涉及利用基因工程的手段，構建了(S)-羰基還原酶（SCRⅡ）和6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）共表達的重組畢赤酵母菌（Pichia?pastoris）SCRⅡG，高效制備(S)-苯基乙二醇，屬于生物催化不對稱轉化技術領域。

背景技術

光學純的苯基乙二醇（PED）是液晶材料中不可缺少的手性添加劑，也是制備具有光學活性的醫藥、農藥和功能材料的重要中間體。生物法轉化制備光學純(S)-苯基乙二醇，通常以微生物全細胞或酶為催化劑，采用不同的化學反應途徑，如Bakers’酵母不對稱還原2-羥基苯乙酮法，環氧化物水解酶催化水解外消旋苯乙烯氧化物法，和萘雙氧化酶（NDO）選擇性氧化苯乙烯法等，這些方法存在底物濃度低，需要昂貴的輔酶，產物光學純度低等缺點。氧化還原酶催化的不對稱還原反應中，輔酶不能循環使用是限制其工業化應用的“瓶頸”因素。

全細胞體系輔酶再生主要有兩種策略：一是在反應體系中添加醇或糖類輔助底物，構成底物耦聯再生系統；二是通過基因工程手段在細胞中構建酶耦聯再生系統。如Degussa公司利用該輔酶再生的原理催化三甲基丙酮酸不對稱還原合成L-叔亮氨酸，大大提高了產物的轉化率。ω-轉氨酶、醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶組成的耦聯體系用于高效轉化(R)-苯乙醇。

本實驗室已經利用重組菌株催化不對稱還原反應，制備(S)-苯基乙二醇，在此基礎上，利用基因工程技術，將釀酒酵母6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）基因ZWF1與近平滑假絲酵母(S)-羰基還原酶基因scrⅡ整合至畢赤酵母基因組中，構建了共表達偶聯體系Pichia?pastoris/SCRⅡG，在5%?(w/v)?葡萄糖的參與下，Pichiapastoris/SCRⅡG不對稱還原2-羥基苯乙酮的催化效率大大提高，反應十個批次后，產物(S)-苯基乙二醇光學純度和產率分別高達100%和85%以上。

發明內容

（1）要解決的技術問題

本發明的目的是提供一種基因工程方法構建多酶偶聯體系，實現了多種酶功能的成功整合。利用酶偶聯后的重組菌株Pichiapastoris/SCRⅡG?(菌種保藏號：CGMCC?No.4198)高效不對稱轉化制備(S)-苯基乙二醇的方法。本發明根據釀酒酵母6-磷酸葡萄糖脫氫酶和近平滑假絲酵母(S)-羰基還原酶的功能，利用基因工程技術，構建雙酶偶聯畢赤氏酵母體系，以酶偶聯重組菌為催化劑，實現了從2-羥基苯乙酮到(S)-苯基乙二醇的高效轉化。在5%?(w/v)?葡萄糖的參與下，當底物濃度為6?mg/mL?時，經過十批次的催化反應，產物(S)-苯基乙二醇光學純度高達100％，產率維持在85%以上。本發明為解除輔酶再生循環的限制，成功整合雙酶功能，提高手性醇制備效率提供了一條嶄新的思路。

（2）技術方案

一株不對稱制備(S)-苯基乙二醇的重組菌，其分類命名為巴斯德畢赤酵母（Pichia?pastoris）SCRⅡG?，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：CGMCC?No.4198。

利用重組菌CGMCC?No.4198不對稱轉化制備?(S)-苯基乙二醇的方法，不對稱轉化反應條件：在0.1?mol/L?pH?5.5的醋酸緩沖液中，加質量/體積比5%葡萄糖，底物2-羥基苯乙酮的濃度為6?mg/mL，重組菌細胞濃度為0.1?g/mL，不加輔助底物，反應溫度為35℃，反應時間為24?h，轉速150?r/min，重組菌菌體重復利用十個批次。

反應結束后，將反應混合物離心除去菌體，上清液加入2倍體積乙酸乙酯萃取，有機相用于分析。產物通過手性固定相高效液相色譜(Agillent?HP1100)?進

行分析，條件為Chiralcel?OB-H柱(4.6?mm?×25?cm;?Daicel?Chemical?Ind.,?Ltd.,?Japan)，流動相為正己烷/異丙醇（9/1，V/V），流速0.5?mL/min，檢測波長為215?nm。產物的光學純度通過對映過量值來衡量。