[發明專利]6-磷酸葡萄糖脫氫酶和(S)-羰基還原酶偶聯提高(S)-苯基乙二醇轉化效率的方法

有效

• 申請號: 201010534231.2
• 申請日: 2010-11-08
• 公開（公告）號: CN101993828A
• 公開（公告）日: 2011-03-30
• 發明（設計）人: 張榮珍;徐巖;張波濤;耿亞維
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/53;C12N15/81;C12P41/00;C12P7/22;C12R1/84
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一株不對稱制備(S)-苯基乙二醇的重組菌，其分類命名為巴斯德畢赤酵母（Pichia?pastoris）SCRⅡG?，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：CGMCC?No.4198。

2.利用重組菌CGMCC?No.4198不對稱轉化制備?(S)-苯基乙二醇的方法，其特征在于不對稱轉化反應條件：在0.1?mol/L?pH?5.5的醋酸緩沖液中，加質量/體積比5%葡萄糖，底物2-羥基苯乙酮的濃度為6?mg/mL，重組菌細胞濃度為0.1?g/mL，不加輔助底物，反應溫度為35℃，反應時間為24?h，轉速150?r/min，重組菌菌體重復利用十個批次。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于重組菌的培養

BMGY培養基，以質量/體積%計：酵母膏1%，蛋白胨2%，?甘油1%，pH?6.0、100?mmol/L磷酸緩沖液10%，YNB?1.34%，生物素4×10^-5?%，用去離子水補足至100%；

BMMY培養基，以質量/體積%計：酵母膏1%，蛋白胨2%，甲醇0.5%，?pH?6.0、100?mmol/L磷酸緩沖液10%，YNB?1.34%，生物素4×10^-5?%，用去離子水補足至100%；

培養條件：將重組菌CGMCC?No.4198按1%的接種量接種于裝有25?mL?BMGY培養基的100?mL搖瓶中，在28℃、250?r/min的條件下，培養至菌濃OD₆₀₀=2-6；室溫3000?g離心5?min，收集菌體，用100?mL?BMMY重懸菌體，使OD₆₀₀為1.0，置于500?mL的搖瓶中，在28℃、250?r/min的條件下培養，每12?h，按培養基質量/體積%計添加甲醇0.5%至培養基中，培養96h，10,000?rpm離心10?min，沉淀用生理鹽水洗滌兩次，收集得到重組菌全細胞。

4.權利要求1所述重組菌CGMCC?No.4198的構建方法，其特征在于將scrⅡ基因插入pPIC3.5K中構建重組質粒pPIC3.5K-SCRⅡ，電擊轉化畢赤氏酵母GS115感受態細胞，獲得重組菌Pichia?pastoris/pPIC3.5K-SCRⅡ；同時將基因ZWF1插入載體pPICZα，獲得重組質粒pPICZα-ZWF1，用SacI對?pPICZα-ZWF1進行單酶切線性化，電轉化感受態重組畢赤酵母Pichia?pastoris/?pPIC3.5K-SCRⅡ的感受態細胞，涂布含有100?μg/mL?Zeocin的YPD平板，挑取陽性單克隆得到重組菌Pichia?pastoris/SCRⅡG。

5.根據權利要求4所述的構建方法，其特征是重組質粒pPIC3.5K-SCRⅡ的構建：利用限制性內切酶BamH?I和Not?I分別對載體pPIC3.5K和基因片段scrⅡ進行酶切，純化后的基因片段與載體通過粘性末端進行連接，獲得重組質粒pPIC3.5K-SCRⅡ。

6.根據權利要求4所述的構建方法，其特征是重組質粒pPICZα-ZWF1的構建，利用限制性內切酶BstB?I?和Xho?I分別對載體pPICZα和基因片段ZWF1進行

酶切，純化后的基因片段與載體通過粘性末端進行連接，獲得重組質粒pPICZα-ZWF1。

7.根據權利要求4所述的構建方法，其特征是基因片段scrⅡ的獲取：實驗室已知scrⅡ基因全序列，以近平滑假絲酵母的基因組為模板，設計含有

BamH?I酶切位點的引物SCRⅡ_pPIC3.5K_F和含有NotI酶切位點的引物SCRⅡ_pPIC3.5K_R，通過PCR，獲得scrⅡ基因全長。