[發明專利]多孔殼聚糖支架、神經干細胞多孔殼聚糖支架及其用途

無效

• 申請號: 201010532905.5
• 申請日: 2010-11-04
• 公開（公告）號: CN101979104A
• 公開（公告）日: 2011-02-23
• 發明（設計）人: 金國華;衣昕;田美玲;秦建兵;毛偉峰;高宜錄
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: A61L27/20
• 分類號: A61L27/20;A61L27/38
• 代理公司: 南通市永通專利事務所 32100
• 代理人: 葛雷

技術領域

本發明涉及一種組織工程制品及其用途。?

背景技術

中樞神經系統(central?nervous?system，CNS)損傷后的再生一直是困擾人類的難題，雖然1992年Reynolds和Richards最先從成鼠的紋狀體和海馬中分離出了神經干細胞(neural?stem?cells，NSCs)，此后人們又相繼發現成年哺乳動物CNS中的大腦皮質、嗅球、隔區、脊髓等其它區域也存在NSCs，從而打破了傳統認為CNS成年后不能再生的觀念，但是內源性的NSCs應對CNS損傷產生新的功能性神經元的能力有限。NSCs能夠在體外擴增并分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞。隨著胚胎和成體神經干細胞分離、培養技術的成熟，移植外源性NSCs為治療CNS損傷和神經系統退行性病變提供了廣闊的應用前景。目前，利用外源性NSCs移植治療帕金森病、老年性癡呆、脊髓損傷、休克、癲癇、精神病等神經系統疾病取得了不少進展。?

創傷性腦損傷(traumatic?brain?injury，TBI)是以細胞丟失為主要特征的進行性退行性病變。以往TBI的治療側重于藥物治療以減輕急性期的繼發性腦損傷和提高慢性進展期存活腦組織的功能，而細胞移植作為TBI治療手段之一只在最近才開始被研究。作為可移植的細胞種類很多，如永生化祖細胞、NSCs、胚胎神經組織、骨髓基質細胞、臍血細胞、有絲分裂后神經元等。而NSCs具有多分化潛能、低免疫原性、取材容易、來源廣泛等特點，因此從臨床應用和倫理角度都具有更大的優勢。以往的研究大多是單純的細胞移植或聯合某種因子移植來治療TBI，但移植物的長期存活仍然存在較高的可變性，為了移植的細胞能真正替代中樞神經系統損傷丟失的細胞，移植的細胞必須有足夠的存活數量以替代死亡的細胞，因此有必要在損傷區想方設法重建組織結構以利于再生。研究發現如果不給予干預因素，大部分NSCs分化成了膠質細胞，僅少數分化為神經元。單純的細胞移植由于缺乏必要的三維空間物質基礎而不利于NSCs的存活和遷移，也不利于應用干預因素促進NSCs向?神經元分化。隨著21世紀生命科學中組織工程(tissue?engineering)的興起，為真正地實現細胞替代療法提供了新的希望。?

組織工程是應用生命科學和工程學的基本原理，開發能恢復、維持或改善受損組織或器官功能的生物替代物。新生的組織工程化組織首先需要構建細胞----支架復合物，主要包括合適的細胞載體及種子細胞，其關鍵之一就是組織工程三維多孔支架載體的制備。支架載體的三維空間結構可以為細胞提供獲取營養、氣體交換、排泄廢物和生長代謝的場所，為人為地加入干預因素調控種子細胞的分化提供了條件，也是形成新的具有形態和功能的組織、器官的物質基礎。在應用組織工程修復神經系統的研究中，理想的載體應與細胞外基質類似，與活體細胞有良好的生物相容性。殼聚糖的結構和某些性質與細胞外基質中的主要成分氨基多糖極其相似，而且表面高密度的正電荷有利于粘附帶負電荷的細胞。而NSCs由于具有來源廣泛、取材容易和多向分化潛能等特點，是一種理想的種子細胞。?

發明內容：

本發明的目的在于提供一種與神經干細胞具有生物相容性、制備方便、可用于修復腦損傷的多孔殼聚糖支架、神經干細胞多孔殼聚糖支架及其用途。?

本發明的技術解決方案是：?

一種多孔殼聚糖支架，其特征是：由下列方法制備而成：將殼聚糖溶于1％乙酸中成為2％W/V的溶液，向細胞培養板的孔中加入該溶液，蓋好，于4℃預冷，再置于-28℃冷凍過夜，后在-60℃下冷凍干燥，然后向細胞培養板的孔中加入0.1mol/L?NaOH水化處理，再用pH7.2的0.01mol/L?PBS清洗，最后再進行兩次-60℃冷凍干燥，得到多孔殼聚糖支架。?

所述的多孔殼聚糖支架，由下列方法制備而成：將殼聚糖溶于1％乙酸中成為2％W/V的溶液，向24孔細胞培養板每孔中加入1ml該溶液，蓋好，于4℃預冷6h，再置于-28℃冷凍過夜，后在-60℃下冷凍干燥24h，然后向每孔中加入0.1mol/L?NaOH?1ml水化20min，再用pH7.2的0.01mol/L?PBS清洗3次，最后再進行兩次各24小時-60℃冷凍干燥，得?到多孔殼聚糖支架。?

一種神經干細胞多孔殼聚糖支架，其特征是：由下列方法制成：取神經干細胞克隆球接種于培養孔內滅菌的殼聚糖多孔支架上，加入DMEM/F12(即培養基中含有DMEM和F12兩種成分)無血清培養基或加入含NGF的DMEM/F12無血清培養基，培養得到神經干細胞多孔殼聚糖支架。?