[發明專利]一種用百草枯篩選轉基因植物的方法

有效

• 申請號: 201010530688.6
• 申請日: 2010-10-29
• 公開（公告）號: CN102061308A
• 公開（公告）日: 2011-05-18
• 發明（設計）人: 夏勉;喬琳;王麗英;孔祥鳳;劉軍華;李毅
• 申請（專利權）人: 北京未名凱拓作物設計中心有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 北京君尚知識產權代理事務所(普通合伙) 11200
• 代理人: 董琍雯

技術領域

本發明屬于轉基因植物技術領域，具體而言，本發明涉及用于百草枯抗性的轉基因植物的規模化篩選的雙蛋白表達的表達盒以及基于該表達盒的載體、規模化篩選百草枯抗性的轉基因植物和規模化篩選百草枯抗性和非百草枯抗性的抗性的轉基因植物的方法。

背景技術

轉基因技術是現代生物技術的核心，利用轉基因技術生產優質、多抗、高效、多產的作物新品種，是緩解資源束縛、保護環境安全以及拓展農業功能的重要途徑。發展和完善現有轉基因技術具有重要的實際應用價值。在實際基因轉化操作過程中，只有小部分的植物細胞能夠吸收外源DNA并整合到植物基因組上，仍有大部分植物細胞處于未轉化狀態，為了從數目龐大的植物細胞中篩選得到外源DNA整合的植物細胞，需要篩選標記基因的輔助。現在常用的篩選標記基因主要有抗生素類和除草劑兩類。

抗生素抗性基因因具有高轉化效率和方便篩選等優點而成為最常用的篩選標記。但是人們擔心抗生素抗性基因會轉移到微生物中，使病原菌帶有抗生素抗性從而導致臨床上抗生素使用失效。另一方面，抗生素的價格昂貴，作為篩選標記成本高。因此，抗生素抗性基因作為篩選標記多用于科學研究過程中。除草劑抗性基因是近幾年來發展起來的一種新型的篩選標記與抗生素抗性基因相比，除草劑抗性基因具有價格低的優點，也不會產生臨床抗生素失效等擔憂，同時除草劑抗性基因不僅是篩選標記基因還是一種目的基因，能使轉基因作物具有良好的除草劑抗性性狀。現在主要使用的除草劑抗性基因有草甘膦抗性基因和草丁膦抗性基因等，因草丁膦價格相對較高使得草丁膦抗性基因作為篩選標記基因主要用于實驗室研究。草甘膦抗性基因是應用比較多的一種篩選標記基因。雖然除草劑抗性基因是產業化轉基因篩選的優良選擇標記基因，但是其尚未得到大規模的應用。這主要由除草劑抗性基因單一造成的，目前大多數的除草劑抗性基因是草甘膦抗性基因，是在已有的5-烯醇丙酮酰-3-磷酸基因的基礎上修飾得到的，新型的除草劑抗性基因的研究一直沒有顯著進展。研發一種新型的除草劑抗性基因是一項工作量巨大而且具有很大不確定性的工作。

百草枯(paraquat，1，1-二甲基-4，4’-聯吡啶，分子量257.2)是繼草甘磷之后的第二大除草劑，是一種速效觸殺型除草劑，兼有一定內吸作用，主要用于果園、桑園、茶園、林帶等作物的雜草，在農業種植中的廣泛應用已近50年，應用在世界范圍內超過100個國家，受到廣泛接受與歡迎。百草枯是非選擇性除草劑，植物對其吸收非常迅速，即使噴藥后短期內降雨也不影響藥效的發揮。百草枯具有接受廣泛、廣譜性、藥效明顯、價格低等優點，將是一種優良的植物轉基因篩選劑，但是由于百草枯抗性基因的研究一直以來沒有突破性的進展，使得百草枯作為篩選劑也僅僅停留在實驗預想階段。

本發明人通過漫長而艱苦的篩選實驗，構建出一種雙蛋白表達盒，這種雙蛋白表達盒中所選取的具體調控序列及其組合，盡管是順序表達，但是我們發現，后一個表達盒也能高效表達，可以滿足同時有效表達兩個蛋白的需要。根據本發明人選用的顏色辨識基因，大大方便了規模化篩選百草枯抗性基因的過程，并最終篩選得到了一個百草枯抗性基因。在此基礎上，本發明人還發明了一種利用百草枯篩選轉基因植物的新方法，同時獲得具有百草枯抗性和非百草枯抗性的另一抗性的轉基因植物，也方便了規模化篩選，同時排除了已經被要求或潛在將被要求不能出現在產業應用的抗抗生素基因的使用，具有很大的實際應用價值和市場推廣前景。

發明內容

本發明提供了用于百草枯抗性的轉基因植物的規模化篩選的雙蛋白表達的表達盒以及基于該表達盒的載體、規模化篩選百草枯抗性的轉基因植物和規模化篩選百草枯抗性和非百草枯抗性的抗性的轉基因植物的方法。這些產品和方法大大方便了篩選操作，從而可以規模化應用，并且可以滿足同時有效表達兩個蛋白的需要，尤其是在順序表達時后一個表達盒也能高效表達；這些產品和方法還可以排除已經被要求或潛在將被要求不能出現在產業應用的抗生素基因的使用。另外，本發明還涉及各種中間產物，如檢測引物對，用于檢測轉基因植物中的異源蛋白。