[發明專利]日本沼蝦線粒體基因組全序列擴增的方法

無效

• 申請號: 201010529152.2
• 申請日: 2010-11-02
• 公開（公告）號: CN102010860A
• 公開（公告）日: 2011-04-13
• 發明（設計）人: 李家樂;馬克異;馮建彬;姜虎成
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 上海天翔知識產權代理有限公司 31224
• 代理人: 陳學雯

技術領域

本發明涉及一種線粒體基因組全序列擴增的方法，尤其涉及日本沼蝦線粒體基因組全序列擴增的方法，屬于分子生物技術領域。

背景技術

日本沼蝦(Macrobrachium?nipponense)俗稱青蝦，隸屬于甲殼綱，十足目，長臂蝦科，沼蝦屬。日本沼蝦具有適應性強，分布廣，食性雜，生長快，養殖經濟效益高等特點，是我國最重要的淡水經濟蝦類。目前對日本沼蝦的研究工作多數集中于生長特性、核型分析和育苗等方面，而有關使用分子生物學方法對日本沼蝦的研究卻相對較少，主要集中于對核基因組遺傳多樣性方面的分析，因此，目前日本沼蝦分子生物學方面的信息量仍十分有限，開展更為廣泛的分子水平上的研究極為重要。

1981年，Anderson用氯化銫密度梯度分離得到線粒體DNA(mtDNA)，進行了全序列分析。線粒體(mitochondrion)是真核細胞內重要的細胞器，絕大多數動物線粒體呈環狀。由于它分子結構小、結構簡單、進化速度快(線粒體基因的堿基替代率比單拷貝的核基因組快5-10倍)等特點使得其成為動物起源進化及群體遺傳分化的理想研究對象。不同的生物線粒體基因組在結構、基因數量和基因排列方式等各方面均顯示出極大的多樣性，因此線粒體基因組的全序列研究就成為了動物分子系統發生最有力的證據。

目前，有研究建立了一種不需要提取線粒體基因組DNA而直接用線粒體進行聚合酶鏈反應(PCR)的方法：將得到的線粒體用高溫加熱，使線粒體膜破裂，釋放DNA后，直接用于PCR擴增。但此方法只適用于對線粒體基因組DNA純度沒有特別要求的實驗。而隨著分子生物學技術的發展，分子生物學的實驗技術也在日趨完善，實驗要求也在逐步提高。日本沼蝦線粒體遺傳多樣性與動物分子系統發生的分析的基本要求是線粒體基因組全序列的擴增，而線粒體基因組全序列的擴增首先要獲得具有較高純度和濃度的日本沼蝦線粒體DNA，目前提取線粒體DNA的方法有幾種，如Triton法、堿變性法、蛋白酶K法，但均存在缺點：Triton法提取線粒體基因組DNA的產量低，而且容易降解；堿變性法要求的實驗條件比較嚴格，實驗不容易重復而且提取的線粒體DNA可能有環狀和開環兩種結構；蛋白酶K法所需的操作時間較長。本發明中采取高鹽沉淀法進行日本沼蝦線粒體DNA的提取可以彌補以上方法提取線粒體DNA的不足。

一般的PCR法難以擴增5kb以上的長鏈DNA模板，這嚴重限制了PCR法的推廣和應用，通過改變PCR用DNA聚合酶、PCR用Buffer等，可以使長鏈DNA模板的擴增成為可能。本發明使用了LA?Taq聚合酶，此酶在人的染色體上可以擴增長度可達17.5kb的DNA片段，而以λDNA為模板則可以擴增出高達35kb的片段，LA?Taq聚合酶與一般的Taq酶相比，具有校正功能和高保真的特點。

發明內容

本發明就是為了解決上述問題，克服如Triton法、堿變性法、蛋白酶K法，但均存在缺點：Triton法提取線粒體基因組DNA的產量低，而且容易降解；堿變性法要求的實驗條件比較嚴格，實驗不容易重復而且提取的線粒體DNA可能有環狀和開環兩種結構；蛋白酶K法所需的操作時間較長等問題，提供一種日本沼蝦線粒體基因組全序列擴增的方法。

本發明所需要解決的技術問題，可以通過以下技術方案來實現：

一種日本沼蝦線粒體基因組全序列擴增的方法，包括以下部分：

第一部分，高鹽沉淀法提取日本沼蝦線粒體基因組；

第二部分，日本沼蝦線粒體基因中的cytochrome?oxidase?I(簡稱為，CO?I)和16S?rRNA兩個基因片段的擴增；

第三部分，日本沼蝦線粒體基因組DNA的長PCR擴增。

第一部分中，所述高鹽沉淀法提取日本沼蝦線粒體基因組，包括以下步驟：

1)使用液氮將鮮活日本沼蝦肌肉研磨至粉末狀，取50mg轉入一個1.5mL離心管中加入溶液I500μl，混勻，離心后棄上清；

2)沉淀中加入溶液II500μl，混勻，離心后棄上清；

3)沉淀加溶液II100μl，混勻后加入20mg/mL蛋白酶K5μl和10％SDS20μl，快速混勻后進行消化；

4)加入50μl飽和醋酸鈉，混勻，離心后取上清于Eppendrof管中；

5)重復步驟4)一次；

6)上清中加入等體積的酚∶氯仿∶異醇的比例為25∶24∶1，振蕩，離心后取上層水相重復該過程抽提一次，取上層水相；

7)加入2倍體積冰乙醇或等體積異丙醇，冰浴，離心后棄上清；