[發明專利]日本沼蝦線粒體基因組全序列擴增的方法無效
| 申請號: | 201010529152.2 | 申請日: | 2010-11-02 |
| 公開(公告)號: | CN102010860A | 公開(公告)日: | 2011-04-13 |
| 發明(設計)人: | 李家樂;馬克異;馮建彬;姜虎成 | 申請(專利權)人: | 上海海洋大學 |
| 主分類號: | C12N15/10 | 分類號: | C12N15/10 |
| 代理公司: | 上海天翔知識產權代理有限公司 31224 | 代理人: | 陳學雯 |
| 地址: | 201306 上海市*** | 國省代碼: | 上海;31 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 日本 線粒體 基因組 序列 擴增 方法 | ||
1.一種日本沼蝦線粒體基因組全序列擴增的方法,包括以下部分:
第一部分,高鹽沉淀法提取日本沼蝦線粒體基因組;
第二部分,日本沼蝦線粒體基因中的cytochrome?oxidase?I和16S?rRNA兩個基因片段的擴增;
第三部分,日本沼蝦線粒體基因組DNA的長PCR擴增。
2.根據權利要求1所述的日本沼蝦線粒體基因組全序列擴增的方法,其特征在于,第一部分中,所述高鹽沉淀法提取日本沼蝦線粒體基因組,包括以下步驟:
1)使用液氮將鮮活日本沼蝦肌肉研磨至粉末狀,取50mg轉入一個1.5mL離心管中加入溶液I500μl,混勻,離心后棄上清;
2)沉淀中加入溶液II500μl,混勻,離心后棄上清;
3)沉淀加溶液II100μl,混勻后加入20mg/mL蛋白酶K?5μl和10%SDS20μl,快速混勻后進行消化;
4)加入50μl飽和醋酸鈉,混勻,離心后取上清于Eppendrof管中;
5)重復步驟4)一次;
6)上清中加入等體積的酚∶氯仿∶異醇的比例為25∶24∶1,振蕩,離心后取上層水相重復該過程抽提一次,取上層水相;
7)加入2倍體積冰乙醇或等體積異丙醇,冰浴,離心后棄上清;
8)用70%冰乙醇漂洗沉淀,離心后徹底去上清;
9)沉淀于空氣中自然部分干燥,加入50-100μlRTE液溶解,貯于4℃。
3.根據權利要求2所述的日本沼蝦線粒體基因組全序列擴增的方法,其特征在于,所述溶液I為Tris-HCl?10mmol/L,NaCl?10mmol/L,MgCl25mmol/LpH?7.5。
4.根據權利要求2所述的日本沼蝦線粒體基因組全序列擴增的方法,其特征在于,所述溶液II為Tris-HCl?10mmol/L,NaCl?400mmol/L,EDTA?2mmol/LpH?8.0。
5.根據權利要求1所述的日本沼蝦線粒體基因組全序列擴增的方法,其特征在于,第二部分中,所述日本沼蝦線粒體基因中的cytochrome?oxidase?I(CO?I)和16S?rRNA兩個基因片段的擴增,包括以下幾步驟:
1)CO?I和16S?rRNA兩個基因片段引物的選擇:用于擴增日本沼蝦線粒體基因片段的是CO?I通用引物以及16S?rRNA的通用引物;
2)兩個基因片段擴增的PCR反應:反應的模板為權利要求1高鹽沉淀法所提取的日本沼蝦線粒體基因組DNA,為100ng,反應總體系為50μl,其中10×LA?PCR?Buffer?II5μl,dNTPs?2μl、各2.5mmol/L,引物各1μl、20μmol/L,LA?Taq酶0.5μl、2U;
PCR反應條件為:94℃預變性4min;94℃變性45s,54℃退火45s,72℃延伸1min,30個循環,最后72℃延伸10min。
6.根據權利要求1所述的日本沼蝦線粒體基因組全序列擴增的方法,其特征在于,第三部分中,所述日本沼蝦線粒體基因組DNA的長PCR擴增,包括以下步驟:
1)用于日本沼蝦線粒體基因組DNA長PCR擴增的引物設計:以擴增得到的COI基因片段和16S?rRNA片段的序列為模板在兩端分別設計引物,用于擴增日本沼蝦線粒體基因組DNA環的其他部分;
以COI基因片段為起點、16S?rRNA基因片段為終點的半環區域設計的引物對為SrCO?2F和SrCO?2R;
以16S?rRNA基因片段為起點、COI基因片段為終點的半環區域設計的引物對為COSr?2F和COSr?2R;
2)根據設計的長PCR引物序列擴增日本沼蝦線粒體基因組DNA的兩個半環:使用TaKaLa生物公司的LA?Taq聚合酶;
反應條件如下:94℃預變性1min,98℃變性10sec,56.5℃退火30sce,68℃延伸15min;經35個循環后再在72℃延伸15min;
產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,有清晰的條帶;
測序,將得到的序列拼接后,即可得到日本沼蝦線粒體基因組全序列。
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