[發(fā)明專利]日本沼蝦線粒體基因組全序列擴(kuò)增的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010529152.2
• 申請(qǐng)日: 2010-11-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102010860A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李家樂(lè);馬克異;馮建彬;姜虎成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 上海天翔知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31224
• 代理人: 陳學(xué)雯

1.一種日本沼蝦線粒體基因組全序列擴(kuò)增的方法，包括以下部分：

第一部分，高鹽沉淀法提取日本沼蝦線粒體基因組；

第二部分，日本沼蝦線粒體基因中的cytochrome?oxidase?I和16S?rRNA兩個(gè)基因片段的擴(kuò)增；

第三部分，日本沼蝦線粒體基因組DNA的長(zhǎng)PCR擴(kuò)增。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的日本沼蝦線粒體基因組全序列擴(kuò)增的方法，其特征在于，第一部分中，所述高鹽沉淀法提取日本沼蝦線粒體基因組，包括以下步驟：

1)使用液氮將鮮活日本沼蝦肌肉研磨至粉末狀，取50mg轉(zhuǎn)入一個(gè)1.5mL離心管中加入溶液I500μl，混勻，離心后棄上清；

2)沉淀中加入溶液II500μl，混勻，離心后棄上清；

3)沉淀加溶液II100μl，混勻后加入20mg/mL蛋白酶K?5μl和10％SDS20μl，快速混勻后進(jìn)行消化；

4)加入50μl飽和醋酸鈉，混勻，離心后取上清于Eppendrof管中；

5)重復(fù)步驟4)一次；

6)上清中加入等體積的酚∶氯仿∶異醇的比例為25∶24∶1，振蕩，離心后取上層水相重復(fù)該過(guò)程抽提一次，取上層水相；

7)加入2倍體積冰乙醇或等體積異丙醇，冰浴，離心后棄上清；

8)用70％冰乙醇漂洗沉淀，離心后徹底去上清；

9)沉淀于空氣中自然部分干燥，加入50-100μlRTE液溶解，貯于4℃。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的日本沼蝦線粒體基因組全序列擴(kuò)增的方法，其特征在于，所述溶液I為Tris-HCl?10mmol/L，NaCl?10mmol/L，MgCl₂5mmol/LpH?7.5。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的日本沼蝦線粒體基因組全序列擴(kuò)增的方法，其特征在于，所述溶液II為Tris-HCl?10mmol/L，NaCl?400mmol/L，EDTA?2mmol/LpH?8.0。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的日本沼蝦線粒體基因組全序列擴(kuò)增的方法，其特征在于，第二部分中，所述日本沼蝦線粒體基因中的cytochrome?oxidase?I(CO?I)和16S?rRNA兩個(gè)基因片段的擴(kuò)增，包括以下幾步驟：

1)CO?I和16S?rRNA兩個(gè)基因片段引物的選擇：用于擴(kuò)增日本沼蝦線粒體基因片段的是CO?I通用引物以及16S?rRNA的通用引物；

2)兩個(gè)基因片段擴(kuò)增的PCR反應(yīng)：反應(yīng)的模板為權(quán)利要求1高鹽沉淀法所提取的日本沼蝦線粒體基因組DNA，為100ng，反應(yīng)總體系為50μl，其中10×LA?PCR?Buffer?II5μl，dNTPs?2μl、各2.5mmol/L，引物各1μl、20μmol/L，LA?Taq酶0.5μl、2U；

PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性45s，54℃退火45s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的日本沼蝦線粒體基因組全序列擴(kuò)增的方法，其特征在于，第三部分中，所述日本沼蝦線粒體基因組DNA的長(zhǎng)PCR擴(kuò)增，包括以下步驟：

1)用于日本沼蝦線粒體基因組DNA長(zhǎng)PCR擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)：以擴(kuò)增得到的COI基因片段和16S?rRNA片段的序列為模板在兩端分別設(shè)計(jì)引物，用于擴(kuò)增日本沼蝦線粒體基因組DNA環(huán)的其他部分；

以COI基因片段為起點(diǎn)、16S?rRNA基因片段為終點(diǎn)的半環(huán)區(qū)域設(shè)計(jì)的引物對(duì)為SrCO?2F和SrCO?2R；

以16S?rRNA基因片段為起點(diǎn)、COI基因片段為終點(diǎn)的半環(huán)區(qū)域設(shè)計(jì)的引物對(duì)為COSr?2F和COSr?2R；

2)根據(jù)設(shè)計(jì)的長(zhǎng)PCR引物序列擴(kuò)增日本沼蝦線粒體基因組DNA的兩個(gè)半環(huán)：使用TaKaLa生物公司的LA?Taq聚合酶；

反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性1min，98℃變性10sec，56.5℃退火30sce，68℃延伸15min；經(jīng)35個(gè)循環(huán)后再在72℃延伸15min；

產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，有清晰的條帶；

測(cè)序，將得到的序列拼接后，即可得到日本沼蝦線粒體基因組全序列。