[發明專利]高效率轉基因棉花表達載體與應用

無效

• 申請號: 201010521702.6
• 申請日: 2010-10-21
• 公開（公告）號: CN101962658A
• 公開（公告）日: 2011-02-02
• 發明（設計）人: 齊俊生;鞏志忠;陳智忠;王妍卿;羅祖勇;張定朋
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種植物表達載體及其應用，特別是高效率轉基因棉花表達載體與應用。

背景技術

轉基因動物最早的典型例子是1982年由美國華盛頓大學Palmiter等報告的“超級小鼠”。但在這之前，1974年，Jaenisch等用顯微注射的方法將SV40的DNA導入到小鼠的胚囊中，在自帶小鼠的肝、腎組織中檢測到了SV40的DNA，這證明將外源基因導入胚胎細胞中并實現整合是可能的。1980年，Gordon等采用受精卵原核顯微注射法，首次成功地將皰疹病毒和SV40的DNA片段導入小鼠基因組，當時Gordon和Ruddle稱這種轉化小鼠為“轉基因小鼠”。

轉基因植物，1983年采用農桿菌介導方法培育出世界上第一例轉基因植物——轉基因煙草?，F在基因工程已遍及各種動植物及微生物，由于分子生物學技術的飛速發展，轉基因對于改良動植物品質、提高抗逆性以及生物醫藥領域正在發揮巨大的作用。

國內外植物轉基因方法：在植物基因轉化的研究中已建立了多種轉化方法：載體轉化系統、原生質體DNA直接導入轉化、基因槍DNA導入轉化、花粉管通道法等。目前應用最多、機理研究最明確的為載體轉化系統，其載體包括Ti質粒、Ri質粒及病毒轉化載體等?；ǚ酃芡ǖ擂D基因方法由我國科學家發明：周光宇在廣泛調查國內外遠緣雜交工作的基礎上，提出DNA片段雜交假說，并設計了外源DNA直接導入受體的花粉管通道法。

通常轉基因需要構建高效表達載體，為了使得轉基因后的植株容易篩選，一般采用雙元表達載體。常用的植物表達載體為pBI121和pCambia系列。篩選標記基因是指在遺傳轉化中能夠使轉化細胞(或個體)從眾多的非轉化細胞中篩選出來的標記基因。它們通?？梢允罐D基因細胞產生對某種選擇劑具有抗性的產物，從而使轉基因細胞在添加這種選擇的培養基上正常生長，而非轉基因細胞由于缺乏抗性則表現出對此選擇劑的敏感性，不能生長、發育和分化。在構建載體時，篩選標記基因連接在目的基因一旁，兩者各有自己的基因調控序列(如啟動子、終止子等)。目前常用的篩選標記基因主要有兩大類：抗生素抗性酶基因和除草劑抗性酶基因。前者可產生對某種抗生素的抗性，后者可產生對除草劑的抗性。使用最多的抗生素抗性酶基因包括NPTII基因(產生新霉素磷酸轉移酶，抗卡那霉素)、HPT基因(產生潮霉素磷酸轉移酶，抗潮霉素)和Gent基因(抗慶大霉素)等。常用的抗除草劑基因包括EPSP基因(產生5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，抗草甘磷)、GOX基因(產生草甘膦氧化酶、降解草甘膦)、bar基因(產生PPT乙酰轉移酶，抗Bialaphos或glufosinate)等。其中pCambia1301和pCambia3301較為常用。近幾年來，轉基因植物中篩選標記基因的生物安全性已引起全球關注。例如，人們擔心轉基因植物的抗生素抗性標記基因轉移進入人或動物的病原菌中，從而引起這些病原菌對抗生素的抗性，使抗生素失去效力。

pCambia3301采用的bar基因作為標記基因，對轉基因后代采用噴施Basta(一種除草劑)來篩選可以獲得轉基因陽性植株。但經過多年研究發現，噴施Basta對于篩選棉花轉基因陽性植株準確性不高，同時由于國內許多研究部門采用我國首創的花粉管通道轉基因方法，若采用該載體更難以獲得令國際同行信服的研究結果。

pCAMBIA1301載體采用超霉素篩選，也不適合棉花轉基因。為此我們經過多年研究，構建了pSPT高效植物表達載體。

發明內容

本發明的目的是提供一種植物表達載體及其應用。該植物表達載體可以高效率培育轉基因棉花。

本發明所提供的植物表達載體，包括表達tfdA基因的表達盒；所述表達盒由依次連接的CaMV35S啟動子、tfdA基因和終止子組成；所述tfdA基因的核苷酸序列為序列表中序列2，所述CaMV35S啟動子的核苷酸序列為序列表中序列1。

所述植物表達載體中還包括Flag標簽，Flag標簽的核苷酸序列為序列表中序列3。

所述植物表達載體的基礎構架載體為pCambia1300。

所述植物表達載體按照下述方法構建：

1)將CaMV35S啟動子連接于tfdA基因的5′端獲得的片段插入到pCambia1300的BstXI和XhoI酶切位點之間，獲得重組載體A；

2)將序列表中序列3所述的Flag標簽片段插入重組載體A的多克隆位點，獲得所述植物表達載體。