[發明專利]基于單分子力譜的抗癌藥物鑒定方法

有效

• 申請號: 201010521638.1
• 申請日: 2010-10-21
• 公開（公告）號: CN101975854A
• 公開（公告）日: 2011-02-16
• 發明（設計）人: 方曉紅;徐永春;楊勇;師曉麗;梁偉
• 申請（專利權）人: 中國科學院化學研究所
• 主分類號: G01N33/566
• 分類號: G01N33/566;G01L5/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及基于單分子力譜的抗癌藥物鑒定方法。

背景技術

癌癥一直是人類健康的最大殺手。細胞的過度增殖是癌癥發生和發展的原因，而且細胞的過度增殖一般都與配體誘導細胞信號通路尤其是生長因子信號通路的過度激活有關。因此抑制這種細胞信號通路的過度激活，成為治療癌癥的重要途徑。生長因子細胞信號通路的激活首先是通過配體與其膜蛋白受體在細胞膜上結合，使受體產生自聚或異聚而被激活。然后通過激活的受體再磷酸化下游通路的蛋白，使其下游蛋白被激活，從而激活整個信號通路。因此，鑒定出能截斷激活信號通路的任一環節的化合物就能發展治療癌癥的藥物。

目前抗癌藥物分子的主要鑒定方法之一是首先通過計算機模擬從化合物庫中找出一些能與信號通路相關蛋白結合的候選物，然后對這些候選物分子進行細胞水平的實驗，檢測其是否能夠抑制其配體誘導的下游蛋白的磷酸化水平，通過重復這些生化實驗來達到抗癌藥物鑒定的目的，再進一步進行動物實驗。但是在鑒定過程中普遍存在周期長，操作復雜，花費高的問題，難以實現簡便快捷的藥物鑒定。因此，有必要發展一種簡單快捷的藥物鑒定方法。

單分子力譜方法是近年來迅速發展起來的一種檢測技術。該方法不僅有極高的靈敏度，而且還能展現出大量分子檢測時所掩蓋下單個分子力的變化，已日益廣泛地應用于細胞水平對生物分子結構和功能的動態變化、分子間相互作用和生化反應的動力學過程的研究。但目前還未見有利用該方法鑒定抗癌藥物的相關報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于單分子力譜檢測膜蛋白受體-配體相互作用的抗癌藥物鑒定方法。

本發明提供的抗癌藥物的鑒定方法，包括如下步驟：

1)將靶標膜蛋白受體的配體修飾在原子力顯微鏡的針尖上，得到修飾后的針尖；

2)將離體的癌癥細胞進行孵育，孵育完畢后將步驟1)所得修飾后的針尖和孵育后的所述離體的癌癥細胞均置于原子力顯微鏡的樣品池中，測定所述離體的癌癥細胞中所述靶標膜蛋白受體與所述靶標膜蛋白受體的配體之間的結合力，得到所述離體的癌癥細胞中所述靶標膜蛋白受體與所述靶標膜蛋白受體的配體之間的結合幾率A；所述離體的癌癥細胞為含有所述靶標膜蛋白受體的癌癥細胞；

3)將所述離體的癌癥細胞和待鑒定物質進行孵育，孵育完畢后將其與所述步驟1)所得修飾后的針尖均置于原子力顯微鏡的樣品池中，測定孵育后的所述離體的癌癥細胞中所述靶標膜蛋白受體與所述靶標膜蛋白受體的配體之間的結合力，得到所述孵育后的所述離體的癌癥細胞中所述靶標膜蛋白受體與所述靶標膜蛋白受體的配體之間的結合幾率B；所述離體的癌癥細胞為含有所述靶標膜蛋白受體的癌癥細胞；

4)如果所述結合幾率B小于所述結合幾率A，則所述待鑒定物質為候選的抗癌藥物。

上述方法的步驟1)中，常用的各種氮化硅原子力顯微鏡針尖均適用于該方法。所述靶標膜蛋白受體的配體優選為TGFβ1，所述離體的癌癥細胞優選為Hela細胞。所述修飾步驟是將原子力顯微鏡針尖與配體通過化學交聯的方式進行修飾，具體包括如下步驟：a)將所述原子力顯微鏡的針尖置于MPTMS的甲苯溶液中反應，反應完畢后得到硅烷化的針尖；b)將所述步驟a)所得硅烷化的針尖置于ω-氮羥基琥珀酰亞胺酯多聚乙二醇α-馬來酰亞胺((ω-N-hydroxy-succinimide-ester-poly(ethylene?glycol)-α-maleimide，簡稱NHS-PEG-MAL)的二甲基亞砜溶液中進行反應，反應完畢得到活化后的針尖；c)將所述步驟b)得到的活化后的針尖與所述細胞配體于溶劑中進行反應，得到修飾后的針尖。

上述修飾步驟的步驟a)反應步驟中，溫度為18-25℃，優選20℃，時間為1.5-2小時，優選2小時；所述MPTMS的甲苯溶液的體積百分濃度為1％；在所述步驟a)之后，所述步驟b)之前，還對所述硅烷化的針尖進行如下處理：將所述硅烷化的針尖依次用甲苯、丙酮和乙醇洗滌，氮氣吹干；

所述步驟b)反應步驟中，溫度為18-25℃，優選20℃，時間為2.5-3小時，優選3小時；所述NHS-PEG-MAL的二甲基亞砜溶液的濃度為1mg/ml；在所述步驟b)之后，所述步驟c)之前，還對所述活化后的針尖進行如下處理：將所述活化后的針尖用二甲基亞砜進行洗滌，再氮氣吹干；