[發明專利]HIV-gag基因遺傳密碼子優化及艾滋病疫苗的制備方法與應用

無效

• 申請號: 201010521568.X
• 申請日: 2010-10-27
• 公開（公告）號: CN102453722A
• 公開（公告）日: 2012-05-16
• 發明（設計）人: 黃文林;王清濤;張輝;陳玉海;高詩娟
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N15/49
• 分類號: C12N15/49;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N15/66;A61K48/00;A61K39/39;A61P31/18
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及HIV-gag基因遺傳密碼子優化及艾滋病疫苗的制備方法與應用。

背景技術

自1981年發現首例艾滋病病例以來，全世界現已有3340萬人患病，并且正以每天7400人的速度增長，去年因艾滋病及相關疾病死亡的人數就有200萬。由此可見艾滋病的傳播和流行已經對人類健康構成了巨大的威脅，對經濟和社會的發展造成了嚴重的危害。雖然國際社會為防治艾滋病付出了積極的努力，防治工作也有所進展，但艾滋病在全球范圍內的傳播仍未得到有效的控制。在90年代后亞洲取代非洲成為艾滋病增長最快的區域，我國艾滋病的流行也自1994年后進入快速增長期，存在多種艾滋病亞型流行。截至2009年10月底，我國累計報告艾滋病毒感染者和艾滋病人的人數達到319877名，其中病人102233名，死亡人數49845人，如果不加快控制，估計到2010年艾滋病的人數會達到1000萬人。這場“超級瘟疫”給人類帶來了可怕的災難，消耗了巨大的衛生資源，造成了沉重的經濟負擔，同時引發了救治關懷患者，照顧孤兒寡老，消除社會危害和維護群眾健康等一系列社會問題。我國過去采取的宣教和行為干預政策雖然對艾滋病的傳播控制起到了一定的作用，但僅憑這些措施并不能有效地控制艾滋病的傳播?？v觀人類控制傳染病的歷史，可以得到一個重要的啟示，即疫苗仍是控制傳染病最有力、最經濟的武器。所以研制開發系列具有自主知識產權的艾滋病疫苗刻不容緩。

近20年以來很多國家都進行了艾滋病疫苗的開發研究并進行了大量的臨床試驗。由于研究資源、資金、免疫原性等因素多數疫苗僅進入了I期臨床試驗，已進入II期臨床試驗的疫苗包括：重組蛋白亞單位疫苗、非復制型痘病毒疫苗、DNA疫苗、腺病毒載體疫苗等，僅有蛋白亞單位疫苗單獨免疫和與重組金絲雀痘病毒艾滋病疫苗聯合免疫方案進入了III期臨床試驗。2003年2月VaxGen公司宣布其研制的蛋白質亞單位艾滋病疫苗在經歷了3年的III期臨床試驗宣告失敗。由Sanofi-Pasteur公司研制的ALVAC艾滋病疫苗已經進行了多項臨床試驗，以表達HIV-1膜蛋白的ALVAC疫苗臨床實驗，由于70％的接種者不能產生足夠強的細胞免疫反應，NIH終止了美國進行的III期臨床試驗計劃。Merck公司及美國NIH疫苗研究中心聯合開發的以非復制型腺病毒作為載體的艾滋病疫苗在進行II期臨床試驗時也宣告了失敗。美國軍隊在泰國進行的III期臨床試驗與2009年10宣布令世界振奮的消息：免疫組和對照組相比有31％的保護效果，雖然相關的數據還待進一步的分析，但依然讓人們看到了艾滋病疫苗研究的曙光。目前我國艾滋病疫苗研究雖讓取得了一些成績，但從整體上來說在國際上影響力有限。

艾滋病疫苗的研究策略大體經過了三個階段：開始的時候主要利用外殼相關蛋白或者肽誘導機體的體液免疫；后來越來越重視核心蛋白誘導的細胞免疫；現在則重視體液免疫和細胞免疫相結合的策略。＝疫苗本身也從最初的蛋白疫苗、多肽疫苗，變成現在各種病毒載體，DNA載體以及蛋白疫苗相結合的免疫策略。但是病毒載體存在安全性的問題，DNA載體又存在免疫效果差的缺點。艾滋病疫苗研究的當務之急是開發安全有效的疫苗載體，研制具有誘導持久細胞免疫應答及高效特異抗體產生兩種作用疊加的疫苗。

小環DNA載體是一種新型的非病毒基因載體，與質粒載體相比，小環DNA載體僅含有外源基因的表達盒，不包括來自細菌質粒的骨架結構。最新的研究表明，外源基因表達盒與細菌質粒骨架之間的共價連接會導致外源基因的沉默，這是造成質粒載體所攜帶的外源基因在體內只能瞬時表達的主要原因，也是質粒載體臨床應用的主要限制因素。由于不含有來自細菌質粒的骨架結構，小環DNA所攜帶的外源基因可在體內高效表達，其表達效率較質粒載體高10-100倍，且持續表達的時間可長達數月。去除了細菌骨架的小環DNA不含有原核DNA的CpG序列，因此不會引起機體針對基因載體的免疫反應，提高了載體的安全性。此外，小環DNA明顯小于質粒載體，這提高了它在胞外和胞內的生物利用度，從而提高了轉染效率。

艾滋病病毒基因組是兩條相同的正義RNA，每條RNA長約9.2-9.8kb。兩端是長末端重復序列(long?terminal?repeats，LTR)，含順式調控序列，控制前病毒的表達。已證明在LTR有啟動子和增強子并含負調控區。LTR之間的序列編碼了至少9個蛋白，可分為叁類：結構蛋白、調控蛋白、輔助蛋白。gag基因能編碼約500個氨基酸組成的聚合前體蛋白，經蛋白酶水解形成P17，P24核蛋白，使RNA不受外界核酸酶破壞。

發明內容

本發明的目的是提供HIV-gag基因遺傳密碼子優化及艾滋病疫苗的制備方法與應用。