[發(fā)明專利]一種通過BMP15基因高效快速檢測綿羊高繁殖性狀的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010517378.0
• 申請日: 2010-10-25
• 公開（公告）號: CN102051411A
• 公開（公告）日: 2011-05-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 史洪才;白杰;馮利君;牛志剛;梁慶玲;楊丹
• 申請（專利權(quán)）人: 新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院中國—澳大利亞綿羊育種研究中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 烏魯木齊新科聯(lián)專利代理事務(wù)所(有限公司) 65107
• 代理人: 歐詠

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及策勒黑羊BMP15基因編碼序列上的一個(gè)單核苷酸多態(tài)性(簡稱SNP)位點(diǎn)，可作為綿羊高繁殖性狀的一個(gè)分子標(biāo)記，建立了判定該SNP位點(diǎn)基因型的檢測方法。

背景技術(shù)

綿羊?qū)賳翁ゲ溉轭悇游铮承┚d羊品種卻具有穩(wěn)定的多胎性能。研究認(rèn)為，BMPR-IB基因，GDF9基因和BMP15基因?qū)刂凭d羊多胎性能有重要價(jià)值，尤其發(fā)現(xiàn)在以上三個(gè)基因序列中的堿基改變，可以顯著影響綿羊的繁殖性狀。FecB基因是在綿羊上發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)多胎主效基因，該基因是BMPR-IB基因上的一個(gè)堿基發(fā)生突變產(chǎn)生，同樣在GDF9和BMP15上也發(fā)現(xiàn)能夠影響綿羊產(chǎn)羔性能的基因。

在我國的多胎綿羊中，均發(fā)現(xiàn)了FecB基因存在并顯著影響產(chǎn)羔數(shù)，該基因已經(jīng)作為分子標(biāo)記在生產(chǎn)實(shí)踐中廣泛應(yīng)用；但其他多胎主效基因研究還沒有明確的結(jié)論。本發(fā)明研究綿羊多胎主效基因，有助于了解哺乳動物繁殖性狀的作用機(jī)制，同時(shí)可以把多胎主效基因作為分子標(biāo)記，迅速提高綿羊的繁殖性能。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于：提供的通過BMP15基因高效快速檢測綿羊高繁殖性狀的方法，對甄別綿羊的繁殖率具有著重要的科學(xué)價(jià)值，并已得到實(shí)踐的驗(yàn)證。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種通過BMP15基因高效快速檢測綿羊高繁殖性狀的方法，包括1)在策勒黑羊BMP15基因編碼序列中新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)SNP位點(diǎn)，其位點(diǎn)位于Genebank序列(序列號為：NM_001114767.1)從BMP15基因序列的起始密碼子ATG開始+755位點(diǎn)，發(fā)生了T→C突變(簡稱T755C)；2)人工合成一對核苷酸序列作為檢測T755C位點(diǎn)的引物，其正向引物：5′-gaagaccaaacctctccctaagg-3′；反向引物：5′-tactttcaggcccatcatgctcc-3′；上下游引物長度均為23bp，將其結(jié)合到綿羊BMP15基因相應(yīng)的模板鏈上，并擴(kuò)增到含有E+755位點(diǎn)的核酸序列；3)提取DNA，利用引物擴(kuò)增PCR，將產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，用溴化乙錠染色，以凝膠成像確定已擴(kuò)增的目的條帶；4)利用限制性內(nèi)切酶Apa?I對PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化，消化后用8％丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色，以凝膠成像鑒別該綿羊個(gè)體在T755C位點(diǎn)的基因型，將其不同的基因型作為綿羊高繁殖性狀的分子標(biāo)記，用于輔助選擇育種；

上步的T755C位點(diǎn)突變后，造成BMP15蛋白的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，顯著改變了母羊的產(chǎn)羔數(shù)；

上步酶切消化產(chǎn)物大小為140bp時(shí)，表示該個(gè)體沒有高繁殖性能；酶切消化產(chǎn)物大小為120bp和140bp兩條帶時(shí)，表示該個(gè)體具有高繁殖性能。

所述檢測綿羊高繁殖性狀的方法，利用限制性內(nèi)切酶Apa?I識別T755C位點(diǎn)，此序列為C時(shí)能切開，序列為T時(shí)不能被切開。

所述檢測綿羊高繁殖性狀的方法，獲取的BMP15基因T755C位點(diǎn)，因不同基因型個(gè)體間具有不同的繁殖性狀，其不同的基因型可以作為綿羊高繁殖性狀的分子標(biāo)記。

所述檢測綿羊高繁殖性狀的方法，實(shí)驗(yàn)選用的試劑與藥劑均為市售產(chǎn)品。

本發(fā)明構(gòu)思及作用機(jī)理：利用DNA序列分析技術(shù)對策勒黑羊BMP15基因編碼區(qū)序列進(jìn)行了分析，在E+755位點(diǎn)(Genebank序列Access?number：NM_001114767.1起始密碼子ATG開始+755個(gè)堿基)首次發(fā)現(xiàn)了堿基T→C的突變(簡稱T755C)；該核苷酸突變后，造成三聯(lián)密碼子由CTG突變?yōu)镃CG，從而導(dǎo)致編碼亮氨酸的密碼子轉(zhuǎn)變?yōu)楦彼幔養(yǎng)MP15蛋白結(jié)構(gòu)和功能的改變，并顯著影響了母羊的產(chǎn)羔數(shù)。

該方法由于E+755位點(diǎn)不同的基因型，可以作為判斷綿羊個(gè)體是否具有高繁殖性狀的一個(gè)分子標(biāo)記；建立的檢測該位點(diǎn)的高效快速檢測方法，對提高畜牧業(yè)種群的繁育及優(yōu)選有著重要的實(shí)用價(jià)值，彰顯技術(shù)進(jìn)步。

附圖說明

本發(fā)明對照說明書附圖作進(jìn)一步闡述。

附圖1為本方法擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的電泳圖；

如圖所示：泳道1為150bp?Marker，2-8為PCR產(chǎn)物，大小為140bp

附圖2為本方法的內(nèi)酶切消化后的電泳圖；

如圖所示：泳道13為100bp?Marker，1，2，3，4，5，7，9，10，11，12泳道為140bp，6和8泳道為120bp和140bp

具體實(shí)施方式

本發(fā)明對照實(shí)施例作進(jìn)一步說明。

一、體外擴(kuò)增

(1)采集羊外周血液1.5ml，使用肝素納抗凝，經(jīng)過凍融和離心后，收集沉淀的白細(xì)胞，用酚氯仿抽提的方法提取基因組DNA；