[發(fā)明專利]一種快速檢測西布曲明及其衍生物的膠體金層析試紙條及制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010516363.2
• 申請日: 2010-10-22
• 公開（公告）號: CN101980021A
• 公開（公告）日: 2011-02-23
• 發(fā)明（設計）人: 歐衛(wèi)軍;吳迪宏
• 申請（專利權）人: 南通市伊士生物技術有限責任公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/558;G01N33/554;G01N33/531
• 代理公司: 南京眾聯(lián)專利代理有限公司 32206
• 代理人: 顧伯興

1.一種快速檢測西布曲明及其衍生物的膠體金層析試紙條，其特征在于：由襯板（1）和在襯板（1）上依次銜接的樣品墊（2）、金標結(jié)合墊（3）、包被膜（4）和吸水墊（5）組成，金標結(jié)合墊（3）為吸附西布曲明及其衍生物的金標抗體的聚酯纖維氈，在包被膜（4）上有用西布曲明及其衍生物偶聯(lián)的載體蛋白溶液包被直線式檢測線T線（6），和用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對照線C線（7），兩條線豎向平行排列。

2.根據(jù)權利要求1所述一種快速檢測西布曲明及其衍生物的膠體金層析試紙條，其特征在于：所述襯板（1）為不吸水的PCV韌性材料。

3.根據(jù)權利要求1或2所述一種快速檢測西布曲明及其衍生物的膠體金層析試紙條，其特征在于：所述包被膜（4）為硝酸纖維素膜，或混合纖維素膜。

4.根據(jù)權利要求1所述一種快速檢測西布曲明及其衍生物的膠體金層析試紙條，其特征在于：所述吸水墊（5）為植物纖維棉紙。

5.根據(jù)權利要求1所述一種快速檢測西布曲明及其衍生物的膠體金層析試紙條，特征在于：所述西布曲明及其衍生物的金標抗體為膠體金標記的抗西布曲明及其衍生物的單克隆抗體復合物，所述偶聯(lián)西布曲明及其衍生物的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA。

6.一種快速檢測西布曲明及其衍生物的膠體金層析試紙條的制備方法，其特征在于：制備偶聯(lián)西布曲明及其衍生物的載體牛血清白蛋白BSA，用于制備相應的檢測線T線（6）；制備偶聯(lián)西布曲明及其衍生物的載體雞卵清白蛋白，用于制備單克隆抗體，制備西布曲明及其衍生物金標抗體，用于制備吸附西布曲明及其衍生物金標抗體的聚酯纖維氈；制備羊抗鼠IgG抗體，用于制備對照線C線（7），包括如下步驟：

（A）將西布曲明及其衍生物與載體牛血清白蛋白BSA/雞卵清白蛋白OVA進行偶聯(lián)制備人工合成抗原；

a、生成水溶性碳化二亞胺（EDC）：往反應瓶中加入干燥的二甲基甲酰胺（DMF）及那非類原料或拉非類原料，并通N₂保護，在室溫下進行攪拌，待二甲基甲酰胺（DMF）完全溶解后，快速稱取濃度為?60%的氫化鈉（NaH），并將其加入所述反應瓶中，攪拌50-70分鐘，直至溶液無氣泡產(chǎn)生，然后用注射器吸取溴乙酸乙酯慢慢注入所述反應瓶中，注入完畢后，在室溫下攪拌11-13小時，之后將反應液傾入水中分散，以氯仿進行提取，合并提取液，以無水Na₂SO₄進行干燥，之后過濾，再經(jīng)過減壓濃縮后得到固體，加入無水乙醚打漿洗滌所述固體，之后進行過濾，最后真空干燥得到新的固體，此固體為烷基化物；將無水乙醇和上述步驟所得的烷基化物加入新的反應瓶中，進行攪拌分散，再加入NaOH溶液，加熱回流反應2小時，停止加熱稍冷卻后，將反應液轉(zhuǎn)入單口瓶中，減壓濃縮得糊狀物，再加入水，以鹽酸調(diào)節(jié)至pH值為7-9的液體，以氯仿進行提取，合并提取液，再用飽和食鹽水洗一次，以無水Na₂SO₄干燥，過濾，減壓濃縮得白色固體，用甲醇重結(jié)晶，得白色粉狀固體，此固體為水溶性碳化二亞胺（EDC）；

b、生成人工合成抗原：將上述步驟中所得的水溶性碳化二亞胺（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、二甲基甲酰胺（DMF）、半抗原化合物平衡至室溫；取上述步驟中所得的水溶性碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和半抗原化合物，三者的摩爾比為：半抗原化合物：水溶性碳化二亞胺：N-羥基琥珀酰亞胺=1：8-12：13-16，將其置入圓底燒瓶，然后加入上述步驟中所得的二甲基甲酰胺溶解，為保證反應完全，在室溫避光的條件下進行攪拌，最后生成的溶液記為二號反應液；當所述水溶性碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和半抗原化合物在二甲基甲酰胺中反應完全后，現(xiàn)配載體蛋白溶液（BSA?/?OVA），將載體蛋白與硼酸緩沖液按1:0.15-0.2的量溶解于另一容器中的硼酸緩沖液，然后轉(zhuǎn)入另一圓底燒瓶中，此溶液記為三號反應液；將二號反應液按每10秒1滴的速度滴入三號反應液中，直至將二號的反應液加完后，先在室溫避光的條件下進行攪拌，之后在3-5℃條件下避光攪拌，待反應完全后，生成溶液，并將生成的溶液記為四號反應液，四號反應液中載體蛋白與半抗原化合物比例為：1:15-25；等所有反應結(jié)束后，將四號反應液置于20000-30000分子截留透析袋中，透析袋中還裝有0.01-0.02M磷酸鹽緩沖液，pH值為7.0-7.5，將透析袋在3-5℃的條件下進行透析，每隔3-5小時換一次磷酸鹽緩沖液；經(jīng)上述透析步驟最終所得的產(chǎn)品，經(jīng)冷凍干燥為白色絮狀產(chǎn)品，即為人工合成抗原；

（B）將人工合成抗原OVA按常規(guī)方法免疫制備西布曲明及其衍生物的單克隆抗體細胞株，用Babc小鼠免疫制備抗體腹水，將腹水純化得到高純度的單克隆抗體蛋白，測定蛋白濃度，備膠體金標記用；

（C）用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm的膠體金溶液；

（D）用0.1mol/LK2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液至最適PH值（8.5-9.0），將適量純化的單克隆抗體純水透析（4hr）后，加入膠體盆中，室溫電磁攪拌（15-30min），逐滴加入1%絡蛋白溶液，使絡濃度為0.1%，持續(xù)攪拌5min，4℃下15000rpm離心10min，棄去上清去沉淀物，將沉淀物用重懸液重新恢復至原體積混勻，再次離心一次，用重懸溶液將沉淀物混懸至原體積1/20,4℃保存?zhèn)溆茫传@得抗西布曲明及其衍生物單克隆抗體的膠體金標記物，所述重懸液為含5%海藻的0.02Tris-HCL緩沖液；

?（E）將1：20-1:10稀釋的西布曲明及其衍生物膠體進標記抗體噴涂吸附于聚酯纖維氈中，27℃保溫干燥，制備西布曲明及其衍生物金標結(jié)合墊（3）；

（F）在包被膜（4）上用西布曲明及其衍生物偶聯(lián)的載體牛血清白蛋白BSA溶液包被直線式檢測線T線（6），用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對照線C線（7），兩條線豎向平行排列；

（G）試紙條的組裝：將樣品墊（2）、金標組合墊（3）、包被膜（4）和吸水墊（5）依次粘附在襯板（1）上，樣品墊（2）置于襯板（1）的一端，吸水墊（5）置于襯板（1）的另一端，包被膜（4）置于襯板（1）的中間，金標結(jié)合墊（3）置于樣品墊（2）和包被膜（4）之間，即得到用于免疫檢測的西布曲明及其衍生物膠體金層析檢測試驗紙大板，將大板按顧客要求分切成2.5mm-7.0mm寬度規(guī)格的試紙條，密封干燥保存。