[發(fā)明專利]一種利用生物標(biāo)記物估算傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵過程真菌生物量的方法

無效

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• 申請日: 2010-10-18
• 公開（公告）號: CN102453744A
• 公開（公告）日: 2012-05-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周榮清;秦臻;鄭佳;黃鈞
• 申請（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06;G01N30/02
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于固態(tài)發(fā)酵過程微生物群落結(jié)構(gòu)免培法分析領(lǐng)域，麥角固醇是多數(shù)真菌細(xì)胞的主要甾醇類組分，含量穩(wěn)定，是一種可靠的生物量標(biāo)記物，基于樣品麥角固醇分析結(jié)果可以快速估算傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵過程真菌生物量。

背景技術(shù)

固態(tài)發(fā)酵起源于中國，具有幾千年的歷史，由于固態(tài)發(fā)酵具有節(jié)水、節(jié)能的獨特優(yōu)勢，屬于清潔生產(chǎn)技術(shù)，近年來逐步得到世界各國的重視。我國傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵食品，例如白酒、食醋、醬油、豆瓣、腐乳等，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，多采用自然富集接種，獨特的生產(chǎn)工藝與悠久的生產(chǎn)歷史賦予其微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性和時空性，經(jīng)過長期馴化的生產(chǎn)環(huán)境中，也富集了大量適應(yīng)極端環(huán)境的微生物資源；但與此同時，傳統(tǒng)工藝中粗放而不可調(diào)控的發(fā)酵過程，也造成了產(chǎn)品產(chǎn)率低下，勞動強度過大，質(zhì)量存在不穩(wěn)定性等種種隱患，嚴(yán)重制約著傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵行業(yè)的發(fā)展。因此，基于傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵過程微生物群落區(qū)系特定的剖析，有益于了解、認(rèn)識傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)過程中微生物作用的基本規(guī)律，促進在傳承特色生產(chǎn)工藝的基礎(chǔ)上，應(yīng)用微生物培養(yǎng)技術(shù)提高產(chǎn)品質(zhì)量和勞動生產(chǎn)效率，發(fā)掘特色生物資源。由于傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵過程復(fù)雜的組成成分，了解其微生物實際群落變化往往比較困難。基于可培養(yǎng)方法研究傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵過程微生物群落特征，在認(rèn)識其優(yōu)勢微生物種屬所取得的成果，促進了固態(tài)發(fā)酵微生物相關(guān)研究的發(fā)展；基于PCR的免培技術(shù)，在釀酒大曲微生物群落結(jié)構(gòu)剖析研究的應(yīng)用，為從分子生物學(xué)的水平全貌認(rèn)識和了解其群落結(jié)構(gòu)開辟了有效的途徑。但因受多種因素的限制，上述方法在定量揭示微生物群落特征方面存在許多局限。

麥角固醇是真菌細(xì)胞膜的重要組成組分，對確保細(xì)胞膜的完整性，膜結(jié)合酶的活性，膜的流動性，細(xì)胞活力以及細(xì)胞物質(zhì)運輸?shù)绕鹬匾饔谩｛溄枪檀荚谡婢w中含量穩(wěn)定，不僅在活的真菌細(xì)胞中是較幾丁質(zhì)等其它生物組分更靈敏、可靠的生物量標(biāo)記組分，而且易萃取，因此可以采用HPLC檢測并用于表征復(fù)雜微生物群落體系中的真菌含量。利用本專利所述方法估算傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵過程中真菌生物量，至今國內(nèi)外還未見相關(guān)文獻或?qū)＠麍蟮馈?/p>

目前，現(xiàn)有的麥角固醇提取方法多適用于規(guī)模化提取細(xì)胞樣品中的麥角固醇，進而用于工業(yè)或醫(yī)藥原料，如生產(chǎn)“可的松”、“黃體酮激素”、“維生素D₂”等。公開號為(CN1733930A)的專利公開了一種麥角固醇的皂化制備方法，皂化率高，不易乳化，操作簡便；公開號為(CN?1793158A)的專利公開了一種利用蔗糖蜜發(fā)酵后的廢渣為原料提取麥角固醇的工藝，生產(chǎn)成本低，易于工業(yè)化，避免了使用毒性較大的甲苯溶劑；公開號為(CN?1322728A)的專利公開了一種利用廢菌絲體提取麥角固醇的方法，包括細(xì)胞破碎、萃取、結(jié)晶、干燥等步驟，工藝簡單，成本低。上述方法均在大規(guī)模提取麥角固醇方面具有良好的應(yīng)用前景，但操作過程易帶入雜質(zhì)，且麥角固醇回收率偏低，不適用于傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵過程真菌生物量的精確分析。本文所述的改進皂化法提取分析樣品中的麥角固醇，操作精度較高，麥角固醇回收率平均達到99.18％，有效的避免了提取方法帶來的分析誤差，能夠較好的適用于傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵樣品麥角固醇的提取。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種免培法分析傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵過程真菌生物量的方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：1)樣品的預(yù)處理；2)皂化；3)樣品皂化液的萃取；4)樣品麥角固醇的HPLC檢測；5)樣品真菌生物量的分析和估算。采用本發(fā)明的方法估算傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵過程真菌生物量具有以下優(yōu)點：

(1)本發(fā)明采用免培技術(shù)分析固態(tài)發(fā)酵樣品中的真菌生物量，避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)法費時、復(fù)雜的操作過程，解決了大量環(huán)境微生物無法培養(yǎng)所致的分析誤差。

(2)本發(fā)明尤其適用于跟蹤傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵過程真菌群落結(jié)構(gòu)的變化趨勢，能夠在花費較少的人力物力條件下得到較為準(zhǔn)確的估算結(jié)果。

(3)本發(fā)明所述方法條件溫和，操作簡單，應(yīng)用面較廣，具有很高的推廣應(yīng)用價值。

附圖說明

附圖為跟蹤醬油曲制曲過程中真菌生物量的變化趨勢，分析結(jié)果表明醬油曲真菌生物量在36h達到飽和，即可認(rèn)為該醬油曲在制曲36h達到成熟。

具體實施方式

下面給出本發(fā)明的2個實施例，以具體說明利用生物標(biāo)記法估算傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵過程真菌生物量的方法。但在這里需要特別說明的是，實施例是用于對本發(fā)明作進一步的說明，不能理解為是對本發(fā)明的限定。

實施例1