[發(fā)明專利]一種檢測(cè)PCA3基因、PSA基因的液相芯片法及其診斷試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010509924.6
• 申請(qǐng)日: 2010-10-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101942523A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-01-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邵棠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 邵棠
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 上海浦一知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31211
• 代理人: 王函

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及體外診斷檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及前列腺疾病相關(guān)的特異基因PCA3、PSA的液相芯片檢測(cè)方法及其診斷試劑盒。

背景技術(shù)

PCA3(prostate?cancer?antigen?3)基因，又稱DD3(differential?display?code?3)基因，是1999年Bussemakers等發(fā)現(xiàn)的一種功能為非編碼RNA的基因，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成。PCA3基因僅表達(dá)于前列腺組織，在正常前列腺和良性前列腺增生(BPH)組織中其表達(dá)極低或不表達(dá)，而在前列腺癌(PCa)細(xì)胞中呈高表達(dá)。因此，PCA3基因目前被認(rèn)為是前列腺癌最特異的基因。

前列腺特異性抗原(PSA，prostate?specific?antigen)目前雖然已被廣泛應(yīng)用于前列腺癌的普查、診斷、分期、療效觀察和預(yù)后判斷，但PSA基因不具有腫瘤特異性，在前列腺增生(BPH)和前列腺炎等良性病變中也可升高，而且PSA基因并不能提高前列腺癌的早期診斷率。

前列腺穿刺活檢是不同的前列腺疾病鑒別診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其是有創(chuàng)檢查，且常有假陰性的發(fā)生。直腸指診及相關(guān)輔助檢查如B超、MRI(核磁共振成像)等雖為非侵入性，但都有局限性。因此，尋找更加特異、早期、無(wú)創(chuàng)的檢測(cè)手段是前列腺疾病鑒別診斷的必然趨勢(shì)。

當(dāng)前國(guó)內(nèi)外廣泛使用的分子生物學(xué)檢測(cè)前列腺疾病相關(guān)的特異性基因的方法中，熒光定量PCR存在著檢測(cè)通量的局限性，所以都還不能真正滿足臨床診斷檢測(cè)的需要。傳統(tǒng)的固相生物芯片(Biochip)技術(shù)存在著可重復(fù)性差、靈敏度不夠好以及操作繁瑣的突出弱點(diǎn)。因此臨床上需要有一種檢測(cè)方法，能夠迅速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確地對(duì)前列腺疾病相關(guān)的特異基因進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，液相芯片(xMAP)技術(shù)正是這樣一種新型檢測(cè)技術(shù)。

液相芯片能夠?qū)ι倭繕颖具M(jìn)行定性、定量檢測(cè)，具有高通量、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、靈敏度高、線性范圍寬等突出優(yōu)點(diǎn)。該系統(tǒng)是由許多微球?yàn)橹饕|(zhì)構(gòu)成的，在微球的制造過(guò)程當(dāng)中，摻入了兩種不同的紅色分類熒光，根據(jù)這兩種熒光的比例不同，把球形基質(zhì)分為100種，可以標(biāo)記上100種不同的探針?lè)肿樱芡瑫r(shí)對(duì)一個(gè)樣品中多達(dá)100種不同的目標(biāo)分子進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)物的不同，微球表面可以共價(jià)結(jié)合各種各樣的核酸檢測(cè)探針，在雜交反應(yīng)進(jìn)行時(shí)再加上熒光標(biāo)記。在同一反應(yīng)體系中可以同時(shí)加入不同的檢測(cè)微球，這樣就可以利用少量的樣本進(jìn)行快速、高通量的檢測(cè)。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)微流體技術(shù)將微球排成單列快速流經(jīng)液相芯片檢測(cè)儀，每個(gè)微球可同時(shí)被兩束激光檢測(cè)到，紅色激光激發(fā)微球上的紅色分類熒光，將各個(gè)不同的反應(yīng)區(qū)分開(kāi)來(lái)而定性；綠色激光則激發(fā)結(jié)合在待測(cè)樣本上的熒光標(biāo)記進(jìn)行定量。當(dāng)標(biāo)記好的待測(cè)樣本與特定微球上的探針結(jié)合在一起時(shí)，兩束激光所激發(fā)的光均可被檢測(cè)到。最后，通過(guò)計(jì)算機(jī)的高速數(shù)字信號(hào)處理器，可以自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析得出特定微球上的平均熒光強(qiáng)度，從而確定檢測(cè)物的種類和數(shù)量。

本發(fā)明基于液相芯片技術(shù)的高通量、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、靈敏度高、線性范圍寬等突出優(yōu)點(diǎn)，對(duì)前列腺疾病相關(guān)的特異基因進(jìn)行檢測(cè)，能夠在臨床檢測(cè)上得到更好的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種前列腺疾病相關(guān)的特異基因的檢測(cè)方法及診斷試劑盒。該方法及試劑盒包含對(duì)PCA3基因和/或PSA基因進(jìn)行檢測(cè)，可以對(duì)不同程度的前列腺疾病，尤其是前列腺癌進(jìn)行特異和早期診斷、分期、療效觀察和預(yù)后判斷，對(duì)良性前列腺增生和前列腺癌進(jìn)行鑒別診斷，以及對(duì)其他相關(guān)疾病進(jìn)行早期診斷、療效觀察和預(yù)后判斷。本檢測(cè)方法及診斷試劑盒具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度、檢測(cè)迅速等優(yōu)點(diǎn)。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，在本發(fā)明的一方面，提供一種檢測(cè)前列腺疾病相關(guān)的特異基因PCA3基因、PSA基因以及PCA3基因/PSA基因的比值的液相芯片方法，包括以下步驟：

(1)設(shè)計(jì)一種羧基微球Beads，該微球上共價(jià)結(jié)合針對(duì)PCA3基因或PSA基因的mRNA所設(shè)計(jì)的特異性核酸探針；或者設(shè)計(jì)包含兩種不同熒光編碼的羧基微球Beads，每種微球上分別共價(jià)結(jié)合針對(duì)PCA3基因和基因PSA的mRNA所設(shè)計(jì)的特異性核酸探針；所述的PCA3基因可以單獨(dú)作為前列腺癌的特異基因進(jìn)行檢測(cè)，PSA基因可以單獨(dú)作為相關(guān)的前列腺疾病的特異基因進(jìn)行檢測(cè)，PCA3和PSA基因可以組合起來(lái)作為相關(guān)前列腺疾病的特異性基因進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，同時(shí)還可以根據(jù)PCA3基因/PSA基因的比值對(duì)相關(guān)的前列腺疾病進(jìn)行鑒別診斷。PCA3基因和/或PSA基因也可以與其它基因組合起來(lái)作為相關(guān)前列腺疾病的特異性基因進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)；