[發明專利]一種利用溶氧參數控制畢赤酵母發酵生產抗菌肽的方法

有效

• 申請號: 201010505326.1
• 申請日: 2010-10-13
• 公開（公告）號: CN101979649A
• 公開（公告）日: 2011-02-23
• 發明（設計）人: 姜正軍;陳溥言;袁永;蘇曉明;朱孟豪;田建國;王希鳳;孫大明
• 申請（專利權）人: 山東華辰生物科技有限公司
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C12R1/84
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 趙會祥

技術領域

本發明涉及一種利用溶氧參數控制畢赤酵母發酵生產抗菌肽的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

抗菌肽(antibacterial?peptides，ABP)是多細胞真核生物在外源性病原體誘導條件下，其先天免疫系統產生的一類防御性肽類活性物質，其分子質量一般在2-5ku。與傳統抗生素相比，抗菌肽不易使細菌產生耐藥性。

近年來，以酵母為基因工程受體菌的研究引起人們的重視，酵母具有比大腸桿菌更完備的基因表達調控機制和對表達產物的加工修飾及分泌能力，并且不會產生內毒素，是基因工程中良好的真核基因受體菌。自1978年Hinnen等首先試驗酵母轉化成功后，已有人干擾素基因、乙型肝炎表面抗原基因、α-淀粉酶基因等數十種外源基因在酵母中獲得表達。國內研究者大量研究表明，利用酵母表達抗菌肽是一條可行的道路，如能在表達產率上得到進一步提高，將為抗菌肽早日進入臨床應用奠定良好的基礎。

南京農業大學的申艷敏、張素芳等系統研究了各種抗菌肽的構建并通過體外藥敏試驗進行了活性的初步判斷，得到了有意義的幾種抗菌肽。本專利中的抗菌肽以其中的LL-37為例，具體構建過程為：根據GenBank?CAA86115中的LL-37氨基酸序列，選擇畢赤酵母偏好密碼子，采用SOE-PCR方法合成基因。所合成的LL-37基因全長為141bp，并在其N端引入kex2裂解位點，以保證表達抗菌肽具有天然N端?；蚩寺∪雙PICZa-A質粒，構建出分泌型重組酵母表達載體pPICZa-A-LL-37。表達載體經SacI酶切線性化后電轉化導入畢赤酵母菌株X-33，在博來霉素抗性固體平板上長出酵母單菌落后，提取酵母基因組，進行PCR陽性鑒定，再進一步使用搖床進行發酵，取上清液進行藥敏試驗，結果發現，抗菌肽對指示菌株金黃色葡萄球菌Cowan?I(Staphylococcus?aureus)、致病性大腸桿菌K99(Enteropathogenic?E.coli)和雞白痢沙門氏茵(Salmonella?pullorum)的最小抑菌濃度(Minimal?InhibitoryConcentration，MIC)分別為1.56μg/mL，3.12μg/mL，1.56μg/mL。

由于在實際農業生產中，畜禽養殖規模大，發病病原體種類多，發病季節頻繁，搖瓶發酵無法滿足養殖需要，這成為制約抗菌肽進入實際應用的最大障礙。因此，該發明對抗菌肽早日實現發酵罐生產具有重要的指導意義。

中國專利申請CN101270339(申請號：200710027210.x)公開了一種分泌表達蛋白酶的酵母菌培養方法，其特征在于采用無機鹽培養基對重組甲醇營養型酵母進行發酵培養，發酵培養包括酵母菌的生長期和蛋白酶的分泌表達期，在蛋白酶的分泌表達期內根據發酵液溶氧值變化實時控制甲醇的流加補料，用氨水調節發酵液pH值，從而實現蛋白酶的高效表達。該方法需要根據酵母菌所處的不同生長時期，根據溶氧的變化來對酵母的生長進行調控。

在目前公布的與抗菌肽有關的專利中，主要側重點均集中在以下三個方面1、各類抗菌肽基因的構建、電轉、鑒定和篩選的分子生物學過程；2、抗菌肽的人工化學合成以及天然抗菌肽的化學提取法；3、抗菌肽作為殺蟲劑、飼料添加劑以及各類昆蟲抗菌肽有效成分的深加工和應用。鮮有報道發酵過程規律和利用參數反饋進行過程控制的專利，同時到目前為止，國內沒有抗菌肽LL-37基因工程酵母菌的發酵生產方法。

發明內容

本發明提供一種利用溶氧參數指導畢赤酵母發酵生產抗菌肽的方法。

發明概述

本發明根據發酵開始后培養基的溶氧變化判斷誘導開始和誘導繼續的時間點，最大程度地減少了甲醇的使用量，在保證足夠抑菌活性的同時也最大程度地縮短了發酵周期。本發明使用的培養基采用了最簡單的制備工序和最簡單的合理配方，在保證營養成分滿足畢赤酵母的同時也降低了大規模生產的成本。

發明詳述

本發明的技術方案如下：

一種利用溶氧參數控制畢赤酵母發酵抗菌肽的生產方法，其特征在于，步驟如下：

(1)向發酵罐中加入培養基，實消并冷卻后，調節發酵溫度為27～30℃，在通氣量為0.3～1.5vvm、攪拌速度為250～400rpm的條件下，標定溶氧(DO)的百分點，得到發酵培養基；

(2)將活化后的基因酵母菌株接種于發酵培養基中，接種量為10％(v/v)，同時標記為0點，開始發酵，發酵條件為：通氣量為0.3～1.5vvm、攪拌速度為100～400rpm、罐壓為0.02～0.1MPa；