[發明專利]抗結核桿菌CFP-10單克隆抗體TBCA6及應用

無效

• 申請號: 201010504727.5
• 申請日: 2010-10-12
• 公開（公告）號: CN101985474A
• 公開（公告）日: 2011-03-16
• 發明（設計）人: 姚航平;盧洪洲
• 申請（專利權）人: 浙江大學;上海市公共衛生臨床中心
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;C12N5/20;G01N33/577;G01N33/569;C12R1/91
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及抗結核分枝桿菌培養濾液蛋白10(CFP-10)的單克隆抗體的制備及應用，是利用細胞工程、抗體工程技術，獲得分泌抗CFP-10的單克隆抗體的雜交瘤細胞系，通過同品系的小鼠誘導腹水，制備抗CFP-10的單克隆抗體TBCA6，鑒定為IgG1、κ型，再通過親和純化、電泳、免疫等技術實現對該抗體的應用。

背景技術

結核早期診斷技術是一直困擾醫學診斷領域的一個重要難題。20世紀，因抗生素研究的發展和廣泛應用，人類曾成功地控制了結核病。但是，由于抗藥性不斷出現與積累，結核分枝桿菌對于21世紀的人類依然是一個現實威脅。更嚴重的是，近年來，全球人類免疫缺陷病毒(HIV)和艾滋病(AIDS)的流行已成為全球結核病發病率及死亡率第三次回升的主要原因，同時結核病也是AIDS病人最常見的機會感染和致死病因。結核病和艾滋病并發的趨勢，使得治療難上加難。診斷是治療的前提，如果能夠早期診斷，結核病的危害會大幅度減小。中國作為結核菌高感染率地區和HIV感染的快速增長地區，提高結核病及HIV/AIDS合并結核感染的早期準確診斷水平刻不容緩。

傳統的早期診斷手段是結核菌素皮試。這是基于遲發型超敏反應原理的一種皮膚試驗。但是兩個缺陷使得這種診斷方法的意義非常有限。其一：該方法不能區分曾經感染過結核桿菌的健康者與結核桿菌正在活動的發病者；其二：該方法不能區分結核桿菌的感染者與卡介苗的注射者。所以，傳統的早期診斷方法只能提供非常有限的參考信息，確診往往要等到病人出現結核病灶之后。而這時候再做治療已經晚了，特別是對耐藥結核桿菌，病人預后很差。

ELISPOT技術帶來了結核病早期診斷的革命。其一，由于ELISPOT方法采用結核分枝桿菌特異性的多肽，可以避免卡介苗注射者的交叉反應；其二，由于ELISPOT檢測的是病人當時的細胞免疫水平，可以有效區別健康的TB攜菌者與發病的TB活動病人。但是ELISPOT檢測步驟繁瑣，需要特殊儀器設備且試劑昂貴，在多數低收入的結核高負擔國家和地區較難推廣。

發展一種快速、靈敏的結核早期診斷方法已迫在眉睫。基于以上背景，本項目選定目前公認的結核分枝桿菌特異抗原蛋白CFP-10為靶抗原，利用現代生物信息學和分子生物學技術，設計并合成幾段候選的CFP-10特異的抗原肽序列，采用融合雜交瘤技術建立穩定分泌抗結核分枝桿菌特異抗原蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞系，并大量制備、純化和鑒定這些單克隆抗體。譥單克隆抗體的成功獲得，為建立新型的結核病診斷方法——基于免疫學技術的診斷奠定物質基礎。同時對疾病發病機理、診斷、預后及療效判定等方面的研究起到重要作用。

本發明用到雜交瘤細胞技術。該技術將免疫小鼠的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以建立分泌均質抗體的雜交瘤細胞系，也稱為單克隆抗體技術。該技術涉及到動物免疫、細胞培養、細胞融合、細胞克隆培養和免疫測定等一系列方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種抗結核分枝桿菌培養濾液蛋白10(CFP-10)的單克隆抗體，具有SEQ?No.1的氨基酸序列：Ala?Ala?Val?Val?Arg?Phe?Gln?Glu?AlaAla?Asn?Lys?Gln?Lys。該單克隆抗體亞型為IgG1、κ型，命名為雜交瘤細胞株TBCA6，能特異性識別結核分枝桿菌培養濾液蛋白10(CFP-10)的aa?53-66AAVVRFQEAANKQK抗原肽序列?？菇Y核分枝桿菌培養濾液蛋白10(CFP-10)單克隆抗體雜交瘤細胞已由中國典型培養物保藏中心保藏；地址：中國武漢武漢大學；保藏日期：2010年8月17日；保藏編號為：CCTCC?NO.C201083。

本發明的第二個目的提供抗CFP-10單克隆抗體的制備方法，通過以下步驟和技術方案實現：

(1)動物的免疫：選擇6周齡的BALB/C小鼠，以抗原肽(CFP-10的第53-66位氨基酸，14肽AAVVRFQEAANKQK)對小鼠進行免疫。14肽AAVVRFQEAANKQK通過固相法合成，在美國ABI公司的多肽合成儀(431A)上進行，采用Fmoc(9-芴甲氧羰基)方案，合成步驟按照ABI公司的多肽合成操作手冊進行。經高效液相色譜純化，純度＞95％，序列鑒定通過質譜分析。

(2)小鼠骨髓瘤細胞的培養：培養小鼠骨髓瘤細胞SP2/0并使之保持良好的生長狀態用于細胞融合。