[發明專利]抗結核桿菌CFP-10單克隆抗體TBCA6及應用

無效

• 申請號: 201010504727.5
• 申請日: 2010-10-12
• 公開（公告）號: CN101985474A
• 公開（公告）日: 2011-03-16
• 發明（設計）人: 姚航平;盧洪洲
• 申請（專利權）人: 浙江大學;上海市公共衛生臨床中心
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;C12N5/20;G01N33/577;G01N33/569;C12R1/91
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

1.一種抗結核分枝桿菌培養濾液蛋白10的單克隆抗體TBCA6，該單克隆抗體亞型為IgG1、κ型，能與結核分枝桿菌培養濾液蛋白10特異結合，由保藏號為CCTCC?No.C201083的雜交瘤產生。

2.根據權利要求1所述的抗抗結核分枝桿菌培養濾液蛋白10的單克隆抗體TBCA6的制備方法，其特征在于該單克隆抗體通過以下步驟獲得：

(1)小鼠免疫：選擇6周齡的BALB/C小鼠，以特異的抗原肽即結核分枝桿菌培養濾液蛋白10基因的第53-66位氨基酸，14肽AAVVRFQEAANKQK對小鼠進行免疫，每2周一次，共3次，第四次加強免疫3天后用于融合；

(2)小鼠骨髓瘤細胞的培養：培養小鼠骨髓瘤細胞SP2/0并使其保持良好的生長狀態用于雜交瘤細胞融合；

(3)細胞融合：采用聚乙二醇細胞融合法，以BALB/C小鼠腹腔巨噬細胞作為飼養細胞，在融合前一天，接種BALB/C小鼠腹腔巨噬細胞于96孔培養板，含20％FCS的HAT培養基培養一天，將步驟(1)免疫小鼠的脾臟淋巴細胞和步驟(2)小鼠的骨髓瘤細胞混合離心，然后以聚乙二醇介導細胞融合，稀釋融合后的細胞，接種至培養板培養；

(4)雜交瘤細胞的篩選：將上述培養物在含HAT選擇性培養基中培養，在細胞集落長到大小合適時，吸取培養上清液以酶聯免疫吸附檢測法做抗體鑒定，篩選陽性克隆；

(5)雜交瘤細胞的克隆化培養：以有限稀釋法克隆陽性的雜交瘤細胞，將稀釋的細胞接種至96孔細胞培養板，使每孔只有一個細胞生長，形成細胞集落的孔取上清做酶聯免疫吸附檢測，篩選和鑒定陽性克隆，重復克隆若干次，直到雜交瘤細胞的陽性孔率達到100％，將克隆化后的雜交瘤細胞擴大培養并做抗體理化性狀分析和鑒定；

(6)小鼠腹水的誘生：給每只BALB/C小鼠接種5×10⁶的陽性雜交瘤細胞，收集腹水離心，測定抗體效價，并純化腹水中的單克隆抗體；

(7)單克隆抗體的純化：利用Protein?G親和純化法純化腹水中的單克隆抗體。

3.根據權利要求1所述的抗結核分枝桿菌培養濾液蛋白10的單克隆抗體TBCA6在結核分枝桿菌培養濾液蛋白10檢測中的應用。

4.根據權利要求3所述的抗結核分枝桿菌培養濾液蛋白10的單克隆抗體TBCA6在結核分枝桿菌培養濾液蛋白10檢測中的應用，其特征是：通過抗體夾心酶聯免疫吸附試驗、免疫印跡法和免疫沉淀的方法檢測細菌培養物以及各種體液樣本中結核分枝桿菌培養濾液蛋白10的表達。

5.根據權利要求3所述的抗結核分枝桿菌培養濾液蛋白10的單克隆抗體TBCA6在結核分枝桿菌培養濾液蛋白10定量分析中的應用。

6.根據權利要求3所述的抗結核分枝桿菌培養濾液蛋白10的單克隆抗體TBCA6在結核分枝桿菌培養濾液蛋白10定量分析中的應用，其特征是：通過酶聯免疫吸附試驗的方法對在細菌培養物及體液樣本中的結核分枝桿菌培養濾液蛋白10表達水平進行定性和定量。