[發明專利]一種通過基因工程重組技術制備血管鈉肽(VNP)的方法

無效

• 申請號: 201010503402.5
• 申請日: 2010-10-12
• 公開（公告）號: CN101979576A
• 公開（公告）日: 2011-02-23
• 發明（設計）人: 金堅;于軍;李鵬;房聰;陳蘊;朱瑞宇;雷楗勇;姜曰水;朱妙章;陳健康
• 申請（專利權）人: 江南大學;中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12N15/16
• 分類號: C12N15/16;C12N15/70;C07K14/575
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技術領域

本發明涉及到生物領域，具體說是通過基因工程重組技術制備血管鈉肽(VNP)的方法。

背景資料

心腦血管疾病是世界公認的人類健康的“第一殺手”，其中心力衰竭是多數器質性心臟病人如心肌梗死、肺源性心臟病、肥厚型心肌病等幾乎不可避免的結局，心衰的2年死亡率達20％，5年死亡率高達40％。目前，我國心衰患者已達到500萬人以上，隨著人口老年化和高血壓、高血脂、糖尿病和冠心病等患者的人數不斷增加，在未來五年我國心衰患者預計將達到700萬人以上。在我國臨床上治療心力衰竭的藥物有強心劑、利尿劑、擴張血管劑、血管緊張素酶抑制劑、腎上腺素阻滯劑等幾大類藥物。但存在劑量不穩定、毒副作用大等缺點。因此開發一種效果優良、劑量穩定、毒副作用小的新藥是非常迫切和必要的。近年來，通過對心衰發病過程及神經激素激活的研究，使人們逐漸認識到通過調節神經激素激活水平以改變心衰的發生、發展進程，才是治療關鍵。

鈉尿肽家族是近年來發現的一個多肽家族，具有由兩個半胱氨酸通過二硫鍵形成的一個17個氨基酸的環形結構域。鈉尿肽家族在維持機體水鹽平衡、血壓穩定、心血管及腎臟等器官功能方面具有重要意義。近年來，隨著人們逐漸對鈉尿肽家族成員的認識，利鈉肽也成為了研究熱點。人腦鈉肽(human?brain?natriuretic?peptide，hBNP)是鈉尿肽家族成員之一，其基因重組藥物--奈西利肽(nesiritide)已于2001年被美國FDA批準作為治療急性失代償性心力衰竭的臨床用藥。我國也于2005年上市了國家生物制品I類新藥“新活素”(即rhBNP)，同樣用于治療急性充血性心衰。

天然鈉尿肽主要包括ANP、BNP和CNP，它們都有一個二硫鍵形成的、由17個氨基酸殘基構成的環，其中在人ANP氨基酸殘基環的氮末端有6個氨基酸殘基，碳末端有5個氨基酸殘基，人CNP氨基酸殘基環氮末端有5個氨基酸殘基，碳末端沒有氨基酸殘基。ANP具有強烈的利鈉、利尿和擴張動脈效應，但擴張靜脈的效應很弱，CNP利鈉、利尿及擴張動脈的活性很弱，但有強烈的擴張靜脈作用。ANP、CNP結構及生物活性的差異表明，天然鈉尿肽氨基酸環及其羧基端延伸的氨基酸殘基序列可能對其生物活性有重要影響，將ANP氨基酸環羧基端的5個氨基酸殘基加到CNP的相應部位，可能會得到一種具有新活性的鈉尿肽，基于上述設想，Wei等于1993年首先設計并人工合成了具有新的生物活性的鈉尿肽——血管鈉肽(Vasonatrin?pep?tide，VNP)。

VNP是人CNP和ANP的嵌合體，它是在CNP的羧基端加上ANP羧基端的5個氨基酸殘基形成的27肽，其二級結構也具二硫鍵形成的、17個氨基酸殘基組成的環，分子量約為2867Da。其氨基酸序列為：Gly?Leu?Ser?Lys?Gly?Cys?Phe?Gly?Leu?Lys?Leu?Asp?Arg?Ile?Gly?Ser?Met?Ser?Gly?Leu?Gly?Cys?Asn?Ser?Phe?Arg?Tyr。具有新型生物活性的鈉尿肽家族的新成員，已有的研究表明，VNP可能在慢性心力衰竭、高血壓等疾病治療中，較天然鈉尿肽更具應用前景。但是，具有獨特生物活性的VNP似乎并未引起人們的注意和重視，究其原因，一是化學合成只能保證氨基酸序列的一致性，而不能保證化合物與體內該化合物的藥效學結構的相似性；其二，VNP二級結構中含有一17個氨基酸經過螺旋折疊、由二硫鍵連接形成的具藥效學結構的氨基酸環，這對于其生物活性是必需的，化學合成的VNP雖然保證了氨基酸序列的一致性及二硫鍵的形成，但是由于化學合成環境與其在細胞內的折疊環境差別較大，從而很難保證正確的空間構象。本研究室經過分子動力學模擬和核磁共振分析后發現，與生物法獲得的VNP相比，化學法合成的VNP主鏈拓撲結構存在很大的差異，其藥物活性很難保證。

發明內容

本發明的目的就是為了突破目前血管鈉肽(VNP)無法通過生物法來獲得這一瓶頸，提供了一條通過基因工程法來制備血管鈉肽的方法。

我們所采用的大腸桿菌BL21(DE3)原核表達系統，構建pGEX-4T-1質粒體系，表達出可溶性融合蛋白GST-VNP，經親和層析，腸激酶酶切后可獲得具有生物活性的血管鈉肽。

本發明制備血管鈉肽(VNP)的制備方法包括以下步驟：

(1)采用PCR技術將表達VNP的目的基因擴增，并純化其產物；

(2)將純化的PCR產物用EcoR?I與Not?I雙酶切后定向插入經同樣雙酶切的pGEX-4T-1，獲得重組質粒pGEX-4T-1-VNP；