[發明專利]一種通過基因工程重組技術制備血管鈉肽(VNP)的方法無效
| 申請號： | 201010503402.5 | 申請日： | 2010-10-12 |
| 公開（公告）號： | CN101979576A | 公開（公告）日： | 2011-02-23 |
| 發明（設計）人： | 金堅;于軍;李鵬;房聰;陳蘊;朱瑞宇;雷楗勇;姜曰水;朱妙章;陳健康 | 申請（專利權）人： | 江南大學;中國人民解放軍第四軍醫大學 |
| 主分類號： | C12N15/16 | 分類號： | C12N15/16;C12N15/70;C07K14/575 |
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| 地址： | 214122 江蘇省無錫*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 通過 基因工程 重組 技術 制備 血管 vnp 方法 | ||
1.血管鈉肽(VNP)的制備方法，其特征在于以下步驟：
采用PCR技術將表達VNP的目的基因擴增，并純化其產物；
將純化的PCR產物用EcoR?I與Not?I雙酶切后定向插入經同樣雙酶切的pGEX-4T-1，獲得重組質粒pGEX-4T-1-VNP；
將重組質粒pGEX-4T-1-VNP轉化至大腸桿菌JM?109，經培養擴增，抽提純化，測序分析，獲得序列正確的重組質粒；
將測序正確的重組質粒轉化至BL21(DE3)菌，在30℃，0.5mM?IPTG條件下表達重組蛋白；
將表達重組蛋白的活化菌接種到LB+AMP的培養基中，進行搖瓶實驗，工程菌在發酵罐中發酵，至OD600nm0.8時進行IPTG誘導，6小時后放罐，離心得到菌體；
將離心后的菌體沉淀進行細胞破碎，破碎后離心收集上清液，進行GST親和層析，洗脫得到融合蛋白GST-VNP；
將洗脫得到的融合蛋白GST-VNP通過Sephadex?G25凝膠過濾脫鹽，后采用腸激酶切割。切割條件：25℃，pH?7.6，12小時；
酶切后的產物再經GST親和層析去掉GST標簽，采用截留分子量為10000的超濾離心管對酶切后的樣品進行純化，去除少量的殘余腸激酶，得到純品VNP。
將純品VNP在大鼠上采用離體血管環張力法和去膀胱尿液收集法活性評價。
2.按權利要求1所述血管鈉肽(VNP)的制備方法，其特征在于：GST為親和標簽。
3.按權利要求1所述血管鈉肽(VNP)的制備方法，其特征在于：腸激酶酶切。
4.按權利要求1所述血管鈉肽(VNP)的制備方法，其特征在于：生物法獲得的VNP較化學合成法具有更好的活性。
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