[發明專利]海水中有機污染物潛在遺傳毒性的檢測方法

無效

• 申請號: 201010503183.0
• 申請日: 2010-10-11
• 公開（公告）號: CN101975814A
• 公開（公告）日: 2011-02-16
• 發明（設計）人: 高春蕾;王宗靈;王菊英;龐敏;閆啟侖;穆景利
• 申請（專利權）人: 國家海洋局第一海洋研究所
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 張中南

技術領域

本發明屬于海洋污染物檢測技術領域，具體涉及一種海水中有機污染物潛在遺傳毒性的檢測方法。

背景技術

隨著我國經濟與社會的快速發展，大量且多種多樣有機污染物進入到水環境中，使得水體不同程度地表現出致突變性、致癌性和致畸性。由于海洋是地球水域的集中地，各種有機污染物將最終進入海洋，危及海洋生態系統和人類的健康和生命安全。據美國《今日科學》網站報道，首次在全球范圍內對海洋哺乳動物體內有毒污染物的研究已取得初步成果，但結果令人擔憂的是，那些生活在人們認為尚未受到污染的太平洋中部的抹香鯨體內累積了大量的持久性有機污染物(persistent?organic?pollutants，POPs)，這個研究結果就表明全球的水域環境已經受到污染物特別是持久性有機污染物的嚴重破壞。

與常規污染物不同，持久性有機污染物在自然環境中滯留時間長，很難降解，毒性極強，能導致全球性的傳播。這類污染物通過直接或間接的途徑(通過食物鏈)進入人體，會導致生殖系統、呼吸系統、神經系統等人體器官中毒、癌變或畸形，最后造成死亡。而有機污染物等環境誘變劑導致的遺傳毒性是上述致癌、致畸、致突變的遺傳基礎。因此，不論是從保護海洋生態系統還是保障我們人類自身的身體健康和生命安全，建立一種短期、快速、有效的海水中有機污染物遺傳毒性的檢測方法是非常必要的。

發明內容

本發明的目的是提供一種海水中有機污染物潛在遺傳毒性的檢測方法，具體是利用一種海洋浮游植物米氏凱倫藻(Karenia?mikimotoi)與單細胞凝膠電泳技術，建立海水中有機污染物潛在遺傳毒性快速檢測的方法，以彌補現有技術的不足。

本發明采用的米氏凱倫藻隸屬于裸甲藻目凱倫藻屬，為世界廣布種，常見于溫帶和熱帶淺海水域，米氏凱倫藻最顯著的特點是：單細胞，營游泳生活，不具有植物細胞所具有的細胞壁，具有一個大而明顯的細胞核，對水體中理化因素的變化極其敏感。當水體中存在具有遺傳毒性的有機物污染且污染物的濃度超過一定限度時，米氏凱倫藻細胞核中的DNA會發生斷裂，在進行單細胞凝膠電泳檢測(single?cell?gel?electrophoresis?assay，簡稱SCGE，又稱彗星實驗，comet?assay)時斷裂的DNA會形成類似彗星尾部的電泳圖，從而證實水體中存在具有遺傳毒性的有機污染物，并可根據彗星圖像中彗尾的大小等指標，來判斷有機污染物污染程度的高低。

本發明的檢測方法采用以下步驟：

1)海水中有機污染物的提取與濃縮：將海水樣品用液-液萃取法(Liquid-Liquidextraction，LLE)和固相萃取法(Solid?phase?extraction，SPE)提取海水中的有機污染物，并經無水Na₂SO₄干燥柱干燥，二氯甲烷淋洗得到洗脫液，將洗脫液用氮氣吹干，最后用二甲亞砜(DMSO)溶解，得到有機物濃縮液備用；

2)米氏凱倫藻細胞收集和濃縮；選取處于指數生長期的米氏凱倫藻，用5uM的篩絹通過自然沉降法來濃縮和富集；收集完之后用過濾消毒的無菌大洋水洗下來，同時進行顯微鏡計數，調整米氏凱倫藻細胞密度在1×105cells/mL左右，備用；

3)細胞染毒處理：將步驟2)中獲得的細胞與步驟1)的有機物濃縮液在20℃條件下進行染毒處理1h，染毒體系總體積為5mL；染毒體系中有機物濃度分別設為原海水中有機污染物濃度的1倍，5倍，10倍，100倍4個濃度梯度，將未染毒的米氏凱倫藻細胞作為對照組；染毒結束后，以2000轉/分鐘的速度離心去除上清得到米氏凱倫藻細胞，將實驗組和對照組的米氏凱倫藻細胞重新用無菌大洋水懸浮，調整米氏凱倫藻細胞濃度在1×10⁵cells/mL左右，備用；

4)制備第一層膠：配制0.8％的正常熔點的瓊脂糖凝膠NMA，在80℃條件下，從磨砂載玻片的一端垂直流下，鋪滿整個載玻片。將鋪過膠的載片在80℃烤干，晾涼，備用；

5)制備第二層膠：將配好的0.6％低熔點瓊脂糖凝膠LMA，于水浴37℃保溫。取步驟3)中處理后的各實驗組和對照組中的米氏凱倫藻細胞25uL，與75uL低熔點的瓊脂糖凝膠LMA混勻后，取60uL加到鋪有第一層膠的載玻片上，蓋上蓋玻片，4℃黑暗下固化10-30min；

6)細胞裂解：移去第二層膠上的蓋玻片，將鋪有第一層膠和第二層膠(其中混有細胞)的載玻片完全浸入4℃預冷的新鮮配制的裂解液中，4℃黑暗下裂解2h；