[發明專利]海水中有機污染物潛在遺傳毒性的檢測方法

無效

• 申請號: 201010503183.0
• 申請日: 2010-10-11
• 公開（公告）號: CN101975814A
• 公開（公告）日: 2011-02-16
• 發明（設計）人: 高春蕾;王宗靈;王菊英;龐敏;閆啟侖;穆景利
• 申請（專利權）人: 國家海洋局第一海洋研究所
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 張中南

1.一種海水中有機污染物潛在遺傳毒性的檢測方法，其特征在于包括以下的步驟：

1)海水中有機污染物的提取與濃縮：將海水樣品用液-液萃取法和固相萃取法提取海水中的有機污染物，并經無水Na₂SO₄干燥柱干燥，二氯甲烷淋洗得到洗脫液，將洗脫液用氮氣吹干，最后用二甲亞砜溶解，得到有機物濃縮液備用；

2)米氏凱倫藻的細胞收集和濃縮；選取處于指數生長期的米氏凱倫藻，用5μM的篩絹通過自然沉降法來濃縮和富集；收集完之后用過濾消毒的無菌大洋水將米氏凱倫藻細胞洗下來，調整米氏凱倫藻細胞密度在1×10⁵cells/mL左右，備用；

3)細胞染毒處理：將步驟2)中獲得的細胞與步驟1)的有機物濃縮液在20℃條件下進行染毒處理1h，染毒體系總體積為5mL；染毒體系中有機物濃度分別設為原海水中有機污染物濃度的1倍，5倍，10倍，100倍4個濃度梯度，將未染毒的米氏凱倫藻細胞作為對照組；染毒結束后，以2000轉/分鐘的速度離心去除上清得到米氏凱倫藻細胞，將實驗組和對照組的米氏凱倫藻細胞重新用無菌大洋水懸浮，調整米氏凱倫藻細胞濃度在1×10⁵cells/mL左右，備用；

4)制備第一層膠：配制0.8％的正常熔點的瓊脂糖凝膠NMA，在80℃條件下，從磨砂載玻片的一端垂直流下，鋪滿整個載玻片，再將鋪過膠的載片在80℃烤干，晾涼，備用；

5)制備第二層膠：將配好的0.6％低熔點瓊脂糖凝膠LMA，于水浴37℃保溫，取步驟3)中處理后的各實驗組和對照組中的米氏凱倫藻細胞25uL，與75uL低熔點的瓊脂糖凝膠LMA混勻后，取60uL加到鋪有第一層膠的載玻片上，蓋上蓋玻片，4℃黑暗下固化10-30min；

6)細胞裂解：移去第二層膠上的蓋玻片，將鋪有第一層膠和第二層膠的載玻片完全浸入4℃預冷的新鮮配制的裂解液中，4℃黑暗下裂解2h；

7)DNA解旋：將裂解結束后的載玻片用磷酸緩沖液溶液輕輕漂洗3次后，置于水平電泳槽的正極端，倒入新鮮配制的電泳液，使電泳液沒過載玻片約2-3mm，室溫下避光解旋30min；

8)細胞電泳：DNA解旋結束后，在電壓25V，電流300mA的條件下，電泳20-30min；

9)中和：電泳結束后將載玻片置于0.4mmol/L、pH＝7.4的Tris-HCl緩沖液中，中和漂洗3次，每次5分鐘；

10)染色：向第二層膠上滴加50ug/L的碘化丙啶，避光染色5min；

11)顯微照相、圖像分析和數據處理：染色結束后用PBS溶液洗去多余的染料，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察拍照；圖片分析處理采用CASP軟件，主要考察參數為彗星尾距、0live尾距和尾長，每張載玻片分析50-100個細胞；數據分析采用SPSS13.0軟件進行ANOVA分析，將實驗組與對照組進行t-檢驗，P＜0.05作為海水有機污染物潛在遺傳毒性大小的顯著性依據。

2.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于上述的固相萃取法是采用非極性大孔網狀樹脂XAD一2來吸附非極性和弱極性的半揮發性有機污染物。

3.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于上述步驟6)中的裂解液組分如下：

NaCl?146.1g，Na₂EDTA?37.2g，Tris-base?1.2g，肌氨酸鈉10g，調pH至10.0，用去離子水定容至890mL，過濾除菌，室溫保存；臨用前，加入100mL?DMSO和10mL?Triton?X-100。

4.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于上述步驟7)的電泳液制備方法如下：取10N?NaOH溶液30mL，200mM的EDTA溶液5mL，用去離子水定容至1000mL。