[發明專利]一株適冷宿主菌菌株及其應用

無效

• 申請號: 201010502215.5
• 申請日: 2010-10-11
• 公開（公告）號: CN101985607A
• 公開（公告）日: 2011-03-16
• 發明（設計）人: 張玉忠;陳秀蘭;趙殿麗;于子超;解彬彬;何海倫;周百成
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/63;C12N15/66;C12N15/56;C12N9/42;C12R1/01
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 趙會祥

1.一株適冷宿主菌菌株(Pseudoalteromonas?sp.)SM20429，該菌株2010年9月19日保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢武漢大學，其菌種保藏編號為CCTCC?M2010239。

2.權利要求1所述的適冷宿主菌菌株(Pseudoalteromonas?sp.)SM204299的自主復制型表達載體pWD，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

3.權利要求2所述的適冷宿主菌菌株的自主復制型表達載體pWD的構建方法，步驟如下：

a、以質粒pSM429為模板，質粒pSM429的GenBank登錄號EU627679，利用引物ZF：5’-AACTGCAGCAAGACACTGTGAAGG-3’，ZR：5’-CGGGATCCTGCCTTTAAGATTTGC-3’，PfuDNA?Polymerase?PCR擴增質粒pSM429的DNA片段；其中引物的5’端分別加上BamHI和PstI識別位點；PCR產物電泳檢測后，用限制性內切酶BamHI和PstI雙酶切處理，30℃酶切過夜后，純化回收DNA片段；

b、利用限制性內切酶BamHI和PstI處理質粒pUC19，30℃酶切過夜后，瓊脂糖電泳檢測，純化回收大小為2.68kb的DNA片段；

c、將步驟a制得的DNA片段混合液和步驟b制得的DNA片段混合液4μl、5μl連接緩沖液、1μl連接酶混合成10μl反應體系，16℃連接過夜，得質粒；

d、以質粒pBT為模板，利用引物CmB：5’-CGGGATC?CACGGCACCACCCCGTCAG-3’，CmP：5’-CGGAATTCGAAGCACACGGTCACACTG-3’，Pfu?DNA?Polymerase?PCR擴增CAT片段；其中引物的5’端分別加上BamHI和EcoRI識別位點；PCR產物經電泳檢測大小為1.6kb，用限制性內切酶BamHI和EcoRI雙酶切處理，30℃酶切過夜后，純化回收，插入到同樣經酶切處理的通過步驟c構建的質粒中，構建成一個自主復制型表達載體pWD。

4.權利要求3所述的適冷宿主菌菌株的自主復制型表達載體pWD在表達適冷纖維素酶方面的應用，具體步驟如下：

(1)PCR擴增適冷纖維素酶基因cen

以來源于假交替單胞菌屬適冷菌株的適冷纖維素酶基因cen為模板，根據基因兩端序列設計引物(引物序列：F：5’-AACTGCAGTATGGATAACAGT-3’，R：5’-CCGCTCGAGGCCACC?CCAACCTTGAATG-3)，在引物兩端分別設計了PstI和XhoI識別位點。利用PCR方法擴增適冷纖維素酶基因cen；

(2)PCR產物酶切回收

PCR擴增的適冷纖維素酶基因cen經電泳檢測后，用限制性內切酶PstI和XhoI雙酶切處理，用純化試劑盒按說明書純化回收；

(3)質粒pWD的酶切回收

從適冷宿主菌SM20429中純化質粒pWD，將質粒pWD用限制性內切酶PstI和XhoI雙酶切處理，用純化試劑盒按說明書純化回收；

(4)纖維素酶基因cen的表達載體pWD-cen的構建

用連接酶將(2)中制得的酶切后的酶基因連接到(3)中制得的酶切后的質粒pWD中，構建纖維素酶基因cen的表達載體pWD-cen。