[發(fā)明專利]一株適冷宿主菌菌株及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010502215.5
• 申請日: 2010-10-11
• 公開（公告）號: CN101985607A
• 公開（公告）日: 2011-03-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張玉忠;陳秀蘭;趙殿麗;于子超;解彬彬;何海倫;周百成
• 申請（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/63;C12N15/66;C12N15/56;C12N9/42;C12R1/01
• 代理公司: 濟南金迪知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37219
• 代理人: 趙會祥

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一株適冷宿主菌菌株及其應(yīng)用，特別涉及一株適冷宿主菌菌株(Pseudoalteromonas?sp.)SM20429及其應(yīng)用，屬于海洋生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

在生物技術(shù)與生物工程領(lǐng)域中，通過將外源基因克隆于表達載體上，轉(zhuǎn)入到一個合適的宿主細胞中，來達到表達和制備重組蛋白的目的。將這種表達系統(tǒng)應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中，可以用于大量制備重組蛋白，達到工業(yè)化水平。

一個表達系統(tǒng)首先需要一個適于轉(zhuǎn)化外源基因的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，該轉(zhuǎn)化系統(tǒng)應(yīng)包括1)合適的篩選標(biāo)記；2)用于攜帶外源基因進入宿主菌的載體，該載體可在宿主菌中進行復(fù)制；3)一種適合將外源基因引入宿主細胞的轉(zhuǎn)化方法；4)用于轉(zhuǎn)化的宿主菌。大腸桿菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)是目前最廣泛應(yīng)用的兩個表達系統(tǒng)。

地球上的低溫生境非常廣泛，包括深度超過1000米的海洋、極地和許多季節(jié)性的寒冷環(huán)境等等。這些低溫生境中存在大量的微生物，其中大部分為適冷微生物。由于長期生活在低溫環(huán)境下，適冷微生物所產(chǎn)生的酶類等蛋白質(zhì)往往具有適冷特性，即在低溫下的高催化效率和高溫下的低穩(wěn)定性。有研究表明，低溫環(huán)境有利于適冷蛋白的重組表達，可以更有效地得到有活性的適冷蛋白。雖然大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前最成熟和常用的表達系統(tǒng)，但大腸桿菌為中溫菌，最適生長溫度為37℃。在這樣高的溫度下，適冷酶既不穩(wěn)定，也難以進行活性表達。而降低大腸桿菌的培養(yǎng)溫度，會降低大腸桿菌的生長速率和表達效率。因此，大腸桿菌表達系統(tǒng)并不是適冷酶和蛋白重組表達的最佳選擇。由于適冷細菌能在低溫下快速生長，所以建立適冷細菌為宿主的表達系統(tǒng)可以對適冷酶和蛋白進行有效的活性重組表達。近些年，國外雖已有開發(fā)出適冷細菌表達系統(tǒng)的報道，但目前可廣泛應(yīng)用的適冷表達系統(tǒng)非常少。國內(nèi)尚未見有關(guān)適冷細菌表達系統(tǒng)的報道或專利。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株適冷宿主菌菌株及其應(yīng)用。

名詞解釋：

纖維素酶酶活單位(U)定義為35℃下每分鐘釋放1μg葡萄糖所需酶量。

一株適冷宿主菌菌株(Pseudoalteromonas?sp.)SM20429，該菌株2010年9月19日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國武漢武漢大學(xué)，其菌種保藏編號為CCTCC?M2010239。

上述適冷宿主菌菌株是適冷菌BSi20429菌株的質(zhì)粒缺失株SM20429。適冷菌BSi20429菌株是從北極的海冰樣品中分離出來，經(jīng)鑒定為假交替單胞菌屬細菌。對該菌株進行質(zhì)粒消除改造，成功獲得一株穩(wěn)定的質(zhì)粒缺失株SM20429，并將其作為轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的宿主菌。

用于上述適冷宿主菌菌株的自主復(fù)制型表達載體pWD，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

上述適冷宿主菌菌株的自主復(fù)制型表達載體pWD的構(gòu)建方法，步驟如下：

1、以質(zhì)粒pSM429為模板，質(zhì)粒pSM429的GenBank登錄號EU627679，利用引物ZF：5’-AACTGCAGCAAGACACTGTGAAGG-3’，ZR：5’-CGGGATCCTGCCTTTAAGATTTGC-3’，PfuDNA?Polymerase?PCR擴增質(zhì)粒pSM429的DNA片段；其中引物的5’端分別加上BamHI和PstI識別位點；PCR產(chǎn)物電泳檢測后，用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI雙酶切處理，30℃酶切過夜后，純化回收DNA片段；

2、利用限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI處理質(zhì)粒pUC19，30℃酶切過夜后，瓊脂糖電泳檢測，純化回收大小為2.68kb的DNA片段；

3、將步驟1制得的DNA片段混合液和步驟2制得的DNA片段混合液4μl、5μl連接緩沖液、1μl連接酶混合成10μl反應(yīng)體系，16℃連接過夜，得質(zhì)粒；

4、以質(zhì)粒pBT為模板，利用引物CmB：5’-CGGGATC?CACGGCACCACCCCGTCAG-3’，CmP：5’-CGGAATTCGAAGCACACGGTCACACTG-3’，Pfu?DNA?Polymerase?PCR擴增CAT片段；其中引物的5’端分別加上BamHI和EcoRI識別位點；PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測大小為1.6kb，用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI雙酶切處理，30℃酶切過夜后，純化回收，插入到同樣經(jīng)酶切處理的通過步驟3構(gòu)建的質(zhì)粒中，構(gòu)建成一個自主復(fù)制型表達載體pWD。