[發明專利]一種春蘭梅瓣品種的分子特異標記及其獲得方法

有效

• 申請號: 201010502030.4
• 申請日: 2010-10-01
• 公開（公告）號: CN101955933A
• 公開（公告）日: 2011-01-26
• 發明（設計）人: 鄭琪;孫葉芳;趙虎;黃岳夫;林國梅;邢海
• 申請（專利權）人: 鄭琪;孫葉芳;趙虎;黃岳夫;林國梅;邢海
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 紹興市越興專利事務所 33220
• 代理人: 張謙

技術領域

本發明涉及一種春蘭梅瓣品種的分子特異標記及其獲得方法，屬于生物技術領域。

背景技術

二千三百年前就有越王勾踐種蘭渚山可謂全國最早，三百多年來共選育出春蘭品種400多個可謂全國最多，百余年來譽滿神州的春蘭“四大天王”-宋梅、集圓、龍字、萬字均出自浙江。浙江自1645年以來，共選育出春蘭品種600多個，僅紹興地區選育和栽培的春蘭品種就有430多個；品種之多為全國之最。改革開放后，蘭花在紹興市，特別在紹興縣成了農民發家致富的一條捷徑，蘭花產業不斷發展壯大。目前，僅紹興縣蘭花產業從業者達2500多人，蘭花種植面積2000多畝，蘭花產業年產值達1億元以上。文人雅士玩賞的小小蘭花，如今在浙江紹興縣卻成了百萬乃至千萬富翁的“生產線”。在這個縣有1500多農戶長年從事蘭花的收集、馴化和培育。目前，至少有20多戶農民因種植蘭花而資產逾千萬元。

近幾年來，隨著我省經濟的長足發展，人民生活水平的不斷提高，蘭花交流營運也得到不斷升溫。如紹興地區養蘭戶每年以15％以上的速度遞增。目前我省已基本形成一個普遍養蘭的氛圍。從2000年至2006年我省蘭花交易形勢上看，蘭花產業正成為我省人民致富的一條捷徑，正成為我省可持續發展的特色優勢產業。同時我省蘭花產業也面臨著諸多被動因素，嚴重影響著該產業的健康發展。

蘭花是大自然賦予我們的寶貴自然資源，也是我省寶貴的自然資源和經濟資源，近年來，由于蘭花價格的持續上升，一些地區對野生蘭花的采挖比較混亂。目前江浙兩省每年的下山蘭草很少，野生蘭花資源已遭很大程度的破壞，許多山區已經到了亂挖、濫采的地步，目前已無下山草可挖，所以蘭展上已很難找到一些帶有香味的浙江下山春蘭。我國為避免此類現象的發生，除利用法律、法規措施禁止人為破壞和掠奪蘭花野生資源，更重要的是利用現有的蘭花資源，加強新品種的培育和栽培管理技術的研究，利用現有的種質資源以蘭養蘭、以蘭擴蘭，既有效地保護蘭花自然資源，又滿足養蘭愛好者的需要。

發明內容

本發明的目的是為了能對春蘭梅瓣品種進行簡便、快速、準確的鑒定和檢測，提供了一種春蘭梅瓣品種的分子特異標記及其獲得方法。

為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案為：

一種春蘭梅瓣品種的分子特異標記，采用特異性ISSR-PCR擴增引物對春蘭普通品種與梅瓣基因進行擴增，得到大小為550bp的DNA片段即為所述的分子特異標記。

一種春蘭梅瓣品種的分子特異標記的獲得方法，包括如下步驟：

(1)春蘭梅瓣品種的資源收集和基因組DNA的提??；

(2)春蘭梅瓣品種的特異PCR擴增引物的獲得，采用ISSR-PCR技術，經過大量的篩選試驗，獲得特異PCR擴增引物為ACACACACACACACACCTT；

(3)ISSR分子標記的PCR擴增產物的獲得：擴增總體積為20uL，10×PCR?buffer(含mg²⁺)2.0uL，10mmol/L?dNTP(三磷酸脫氧核糖核苷)0.4uL，2.5U/uL?TaqDNA聚合酶0.3uL，10u?mol/L特異PCR擴增引物ACACACACACACACACCTT?2uL，基因組DNA?1uL，ddH₂O(重蒸水)14.3uL；PCR反應條件：94℃3min；94℃45sec，51℃45sec，72℃90sec，38個循環；72℃7min；

(4)電泳檢測：取上述PCR擴增產物2uL，與1uL上樣緩沖液(6×loading?buffer)混勻，點樣于1％的瓊脂糖凝膠上，于1×TBE緩沖液中，8V/cm電壓下電泳，電泳結束后，用EB(溴化乙錠)染色，然后在凝膠成像儀上照相，此時可見550bp大小的特異片段，而其他普通春蘭均未見特異性片段。

所述步驟(1)中，用改良的CTAB法提取基因組DNA，DNA稀釋至20ng/uL，-20℃冰箱貯藏備用。

根據采用這一個特殊引物進行PCR擴增，以能否產生550bpDNA片段作為對梅瓣春蘭進行鑒定和檢測的依據。

該檢測方法與傳統的辨別梅瓣春蘭的方法相比，具有更強的操作性，傳統的方法須等開花之后通過花瓣的花型特征來判定，而該檢測方法在春蘭幼苗時通過嫩葉即可進行檢測，檢測時間短，準確性高。

以下結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步說明。

附圖說明

圖1為梅瓣春蘭專用檢測引物對春蘭進行ISSR-PCR擴增結果。圖中梅瓣春蘭(天興，萬字，瑞梅，宋梅，冠姚和賀梅)均能擴增出分子量約為550bp的特殊DNA條帶，而普通春蘭(普1，普2和普3)則沒有。

具體實施方式