[發明專利]野生茄子耐鹽基因StNHXl植物表達載體

無效

• 申請號: 201010501811.1
• 申請日: 2010-10-11
• 公開（公告）號: CN101955972A
• 公開（公告）日: 2011-01-26
• 發明（設計）人: 朱月林;蓋鈞鎰;陳國戶;楊立飛
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;C12N15/66;A01H5/00
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

一、技術領域

本發明涉及了野生茄子‘Torvum?Vigor’耐鹽基因Na⁺/H⁺反向轉運體(StNHX1)植物表達載體的構建，屬于分子生物學和生物技術領域。?

二、背景技術

土壤鹽漬化是一個世界性難題，全世界鹽漬化土面積約10億公頃；我國鹽漬土面積約3,460萬公頃，耕地鹽堿化760萬公頃，近1/5耕地發生鹽漬化，其中原生鹽化型、次生鹽化型和各種堿化型分布分別占總面積的52％、40％和8％。?

鹽對于植物的毒害作用主要是由于水分虧缺導致的滲透脅迫以及過量的Na⁺對重要生化過程的毒害。植物克服鹽脅迫的機制是Na⁺的外排和液泡區室化。質膜Na⁺/H⁺反向轉運蛋白利用質膜H⁺-ATPase產生的跨膜質子梯度將Na⁺排出細胞，減少Na⁺向葉片中的長距離轉運而保護光合組織免受鹽的毒害。液泡膜Na⁺/H⁺反向轉運蛋白則利用液泡膜質子泵(H⁺-ATPase和H⁺-PPase)產生的跨膜質子梯度將Na⁺區室化進入液泡，不僅減輕了過多Na⁺的累積對細胞質的毒害，而且可以利用NaCl作為溶質維持滲透勢以驅動水分進入細胞。因此，Na⁺/H⁺反向轉運蛋白在植物耐鹽性中發揮著重要作用.?

三、發明內容

技術問題：本發明涉及野生茄子‘Torvum?Vigor’耐鹽基因Na⁺/H⁺反向轉運體(StNHX1)植物表達載體的構建，屬于分子生物學領域。構建的植物表達載體導入農作物，可增強其耐鹽性。?

技術方案：?

野生茄子‘Torvum?Vigor’耐鹽基因Na⁺/H⁺反向轉運體植物表達載體的構建：?

1)野生茄子‘Torvum?Vigor’中StNHX1耐鹽基因的克隆：?

以野生茄子‘Torvum?Vigor’(為日本砧木品種，購自日本Takii種苗株式會社)幼嫩葉片為材料，提取葉片總RNA，取2μg總RNA反轉錄cDNA。根據番茄中耐鹽基因NHX1(Venema?K，Belver?A，Marin-Manzano?M?C，Rodriguez-Rosales?M?P，Donaire?J?P.A?novel?intracellular?K⁺/H⁺antiporter?related?to?Na⁺/H⁺antiporters?is?important?for?K⁺ionhomeostasis?in?plants.J.Biol.Chem.2003，278(25)：22453-22459)的序列(AccessNO.：AJ306630.1)設計引物，在‘Torvum?Vigor’葉片cDNA中擴增耐鹽基因StNHX1：?

上游引物F：5’-GCCGGATCCGCCACCATGGGGTTGGATG-3’?

下游引物R：5’-CCCGAGCTCTCAATGACCACATCCTC-3’?

將PCR產物(1599bp)連接到pMD19-T載體(購自TaKaRa公司)上，命名為?pMD19-StNHX1，測序驗證；?

2)StNHX1基因連接至pBI121質粒：?

BamHI/Sac?I雙酶切質粒pMD19-StNHX1回收StNHX1片段，同樣雙酶切pBI121質粒(購自上海希匹吉生物技術有限公司)回收pBI121-GUS^-(12947bp)；將回收的兩片段用T₄連接酶連接，命名為p121-GUS^--StNHX1，轉化DH5α感受態細胞，后續試驗備用；?

3)StNHX1基因連接至pCAMBIA1301質粒構建植物表達載體：?