[發明專利]一種桔霉素-蛋白偶聯抗原的雙交聯化學合成法及其抗桔霉素單克隆抗體的制備方法

無效

• 申請號: 201010301355.6
• 申請日: 2010-02-08
• 公開（公告）號: CN101845094A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: 李泳寧;郭養浩;汪媛媛
• 申請（專利權）人: 福州大學
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K14/77;C07K14/795;C07K1/14;C07K1/10;C07K16/44
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一種桔霉素-蛋白偶聯抗原的雙交聯化學合成方法，其特征在于，桔霉素先與雙交聯試劑(C2H3O)-(CH2)n-(C2H3O)反應，然后與大分子載體進行偶聯，反應后用甘氨酸封閉，最后經分離純化得到桔霉素-載體偶聯抗原。

2.根據權利要求1所述一種桔霉素-蛋白偶聯抗原的雙交聯化學合成法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)桔霉素的活化：將0.5～10mg桔霉素溶解于0.5～10ml的0.6mol/l氫氧化鈉溶液中，加入0.5～10ml的2mg/ml硼氫化鈉溶液，搖勻后，再加入0.5～10μl的雙交聯試劑，室溫下反應4～10小時；

(2)桔霉素-載體偶聯反應：加入30～600mg碳酸鈉，調節pH9.0～11.0，然后按桔霉素與載體初始摩爾比為10/1～1000/1加入載體，混勻完全后，置于37℃振搖反應，反應24～48小時；

(3)甘氨酸封閉：偶聯反應后，加入100～2000mg甘氨酸進行封閉，置于37℃振搖反應，反應24～48小時；

(4)分離純化：將反應液取出，采用G-25凝膠柱洗脫或透析，收集洗脫液或透析袋內溶液，進行紫外全波長掃描，檢測278nm和319nm波長的吸收值，計算偶聯比，并將偶聯物冷凍干燥后-20℃保存。

3.根據權利要求1或2所述一種桔霉素-蛋白偶聯抗原的雙交聯化學合成法，其特征在于，所述的雙交聯試劑(C2H3O)-(CH2)n-(C2H3O)，n＝2～12，(C2H3O)為環氧基團，雙交聯試劑優選1，4-丁二醇二縮水甘油醚。

4.根據權利要求1或2所述一種桔霉素-蛋白偶聯抗原的雙交聯化學合成法，其特征在于，所用大分子載體為天然蛋白質或含氨基的蛋白化合物、糖化合物、高分子化合物，其分子量為20～1200Kda。

5.根據權利要求1或2所述一種桔霉素-蛋白偶聯抗原的雙交聯化學合成法，其特征在于，所用大分子載體為牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)或匙孔貝血藍蛋白(KLH)。

6.一種由權利1所述桔霉素-蛋白偶聯抗原制備的抗桔霉素單克隆抗體的制備方法，其特征在于，應用雜交瘤細胞技術進行細胞融合和篩選，獲得穩定分泌的抗桔霉素單克隆抗體的雜交瘤細胞株，通過制備腹水和純化，獲得抗桔霉素的單克隆抗體。

7.根據權利要求6所述的一種抗桔霉素單克隆抗體的制備方法，其特征在于，采用雜交瘤細胞技術進行細胞融合和篩選，采用的細胞株為小鼠骨髓瘤細胞SP2/0。

8.根據權利要求6所述的一種抗桔霉素單克隆抗體的制備方法，其特征在于，采用小鼠動物體內生產法制備腹水，采用正辛酸-硫酸銨鹽析法或PEG法對腹水進行純化。