[發明專利]一種桔霉素-蛋白偶聯抗原的雙交聯化學合成法及其抗桔霉素單克隆抗體的制備方法

無效

• 申請號: 201010301355.6
• 申請日: 2010-02-08
• 公開（公告）號: CN101845094A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: 李泳寧;郭養浩;汪媛媛
• 申請（專利權）人: 福州大學
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K14/77;C07K14/795;C07K1/14;C07K1/10;C07K16/44
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明涉及了一種桔霉素-蛋白偶聯抗原的雙交聯化學合成法及其抗桔霉素單克隆抗體的制備方法，屬于生物技術領域。

背景技術

桔霉素或桔青霉素是由青霉、曲霉、紅曲霉等絲狀真菌產生的毒素，具有嚴重肝腎毒性以及致畸、致癌和致突變作用。近年來的調查研究發現，許多食品和農產品中都可檢測到桔霉素，主要原因是與玉米、大米、面包、奶酪、蘋果、梨等農產品或食品的霉變有關。因此，桔霉素引起的食品安全問題越來越受到人們的關注。

紅曲霉菌在我國的應用源遠流長，用紅曲菌發酵可生產多種中國傳統食品，如紅曲酒、紅腐乳、紅曲米等。桔霉素是真菌的次級代謝產物，常伴隨在紅曲色素中產生，在大部分紅曲發酵產品中，桔霉素含量高達歐盟標準的幾十到幾百倍。出于食品安全的考慮，桔霉素已被歐洲各國列為必檢毒素之一。

酶聯免疫檢測法是目前最為靈敏、方便的方法。以單克隆抗體為基礎的酶免疫檢測方法是桔霉素檢測發展的方向。桔霉素是小分子化合物，屬于半抗原，不能有效地刺激機體產生免疫應答反應。桔霉素必須和大分子載體偶聯反應后制成人工偶聯抗原才能激發有效的免疫反應。桔霉素分子量較小(250.3Da)，結構比較簡單，含有三個活性基團，分別是C₁位置的活潑氫、C₇位置的羧基和C₈位置的羥基。在偶聯反應過程中如何保證抗原決定簇基團未被破壞，是關鍵性技術，制備免疫原性強、能刺激機體產生高親和力和高效價抗桔霉素特異性抗體的人工抗原的難度較大。

目前報導的用于桔霉素-蛋白偶聯抗原制備的方法有活性酯法、甲醛加成法和羰基二咪唑法等。活性酯法利用了桔霉素C₇位置的羧基基團進行偶聯反應，許楊等在專利《桔霉素免疫層析檢測試紙及制備方法與應用(CN1603823A)》中采用該法制備了桔霉素-蛋白的人工抗原作為檢測抗原或免疫抗原，獲得的抗體在免疫層析檢測試紙中進行應用，但免疫層析檢測試紙只能用定性檢測，定量檢測所用的試劑盒仍需從國外進口，檢測費用極其昂貴。甲醛加成法則利用了桔霉素C₁位置的活潑氫進行偶聯反應，但該方法反應的pH接近蛋白的等電點，常引起蛋白的大量沉淀，降低了溶液中偶聯產物的得率。羰基二咪唑法則利用了桔霉素C₈位置的羥基進行偶聯反應，劉仁榮等在文獻(劉仁榮，余宙，何慶華等.抗桔青霉素單克隆抗體的研制與鑒定.衛生研究，2007，36(2)：190-193)中報導采用該法制備了桔霉素蛋白偶聯物并免疫小鼠，但未能獲得針對桔霉素的特異性抗體。可見，在偶聯反應過程中如何保證抗原決定簇基團未被破壞，是關鍵性技術。

目前國內尚無商品化的桔霉素ELISA檢測試劑盒，僅有能用于定性檢測的桔霉素檢測試紙(許楊CN1603823A)，其主要原因是無法制備高親和力和高特異性的抗桔霉素抗體，因此合成較強免疫原性的抗原，制備高親和力和高特異性的抗桔霉素抗體具有重要的意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種反應條件溫和、操作簡單的桔霉素-蛋白偶聯抗原的合成方法以及免疫原性強、能刺激機體產生高親和力和高效價抗桔霉素的高特異性抗體的制備方法，可用于進一步制備能對桔霉素檢測進行定量分析的酶聯免疫檢測試劑盒或試紙卡。

本發明采用雙交聯試劑(C₂H₃O)-(CH₂)_n-(C₂H₃O)為偶聯劑。桔霉素先與雙交聯試劑進行反應，然后與大分子載體進行偶聯，反應后用甘氨酸進行封閉，最后經分離純化得到桔霉素載體偶聯抗原。應用雜交瘤細胞技術進行細胞融合和篩選，獲得穩定分泌抗桔霉素單克隆抗體的雜交瘤細胞株，通過制備腹水和純化，獲得抗桔霉素的單克隆抗體。

具體的制備方法包括以下步驟：

桔霉素的活化：將0.5～10mg桔霉素(購自美國sigma公司)溶解于0.5～10ml的0.6mol/l氫氧化鈉溶液中，加入0.5～10ml的2mg/ml硼氫化鈉溶液，搖勻后，再加入0.5～10μl的雙交聯試劑，室溫下反應4～10小時；

桔霉素載體偶聯反應：加入30～600mg碳酸鈉，調節pH9.0～11.0，然后按桔霉素與載體初始摩爾比為10/1～1000/1加入載體，混勻完全后，置于37℃振搖反應，反應24～48小時；

甘氨酸封閉：偶聯反應后，加入100～2000mg甘氨酸進行封閉，置于37℃振搖反應，反應24～48小時；