[發明專利]血清中甘油三酯的兩步酶測定方法

有效

• 申請號: 201010300886.3
• 申請日: 2010-01-28
• 公開（公告）號: CN101762577A
• 公開（公告）日: 2010-06-30
• 發明（設計）人: 李立和
• 申請（專利權）人: 李立和
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78
• 代理公司: 天津市宗欣專利商標代理有限公司 12103
• 代理人: 劉瑛

技術領域

本發明屬于一種包含酶的測定方法；或是利用可見光，通過測試反應的結果產生顏色變化來測試材料的方法，特別是涉及一種用生化分析儀檢測血清中甘油三酯的兩步酶測定方法。

背景技術

血清中甘油三脂(TG)的測定方法一般可分為化學法、酶法和色譜法3大類。早期測定方法是以總脂質與膽固醇和磷脂之差估算。化學法用有機溶劑抽提標本中的TG，去除抽提液中磷脂等干擾物后，用堿水解(皂化)TG，以過碘酸氧化甘油生成甲醛，然后用顯色反應測甲醛。比較準確的是二氯甲烷-硅酸-變色酸法(Van?Handel-Caslson法)，此法抽提完全、能去除磷脂及甘油干擾、變色酸顯色靈敏度高、顯色穩定，至今還是美國疾病控制與預防中心(CDC)的內部參考方法。但因操作步驟繁多、技術要求高而不適于臨床常規檢測工作中應用。色譜法包括核素稀釋/氣相色譜/質譜等方法(ID/GC/MS)，主要用作參考系統中決定性方法的建立及參考物質的制備與定值，此法費用昂貴，樣品處理復雜，難以推廣應用。另外應用高效液相色譜儀測定血清中的甘油三酯，檢測成本高，難以在臨床推廣。

目前國內幾乎所有的臨床實驗室都用酶法檢測血清TG水平，此方法分為一步法和兩步法，雖然方法各異，但一般都包括以下幾個基本反應步驟：用最合適的脂蛋白脂肪酶(LPL)水解TG生成甘油和脂肪酸；水解后的甘油和三磷酸腺苷(ATP)在甘油激酶(GK)和甘油磷酸氧化酶(GPO)的催化下生成H₂O₂，在過氧化物酶(POD)的催化下，H₂O₂，4-氨基安替比林(4-AAP)和2，4-二氯酚(也有使用4-氯酚、苯酚的衍生物、苯胺鹽和苯磺酸鹽，下面就以2，4-二氯酚為代表敘述，其他色原不再重復提起，)形成有色染料(常為醌亞胺類)，這些物質的生成量與樣本中的甘油三酯含量成正比。最后通過分光光度法計算出相應的TG濃度。具體反應見化學反應式1～4。

生化分析儀檢測血清中TG采用的是酶法，一般采用LPL、GPO、POD、4-氨基安替比林和酚等試劑的方法(GPO-PAP法)。其一步法是將LPL、GK、GPO、POD、4-氨基安替比林和2，4-二氯酚、鎂鹽、表面活性劑及防腐劑等成分溶解在Tris-HCl緩沖液中配制成單一試劑。按中華醫學會推薦法配制：Tris-HCl緩沖液每升內含有的主要成分有：Tris?0.15mmol(pH7.6)、2，4-二氯苯酚2.5mmol、MgSO₄10mmol、膽酸鈉3.5mmol、Triton?X-1000.1g、ATP1.0mmol。GK?500U、GPO?3000U、POD1000U、LPL?3000U、4-氨基安替比林1.2mmol。此法具有簡便快速、微量、精密度高的優點，且特異性強，反應線性范圍寬，易達到終點。但由于血清中TG水解后產生的甘油以及血清中原有的游離甘油都參與了反應，所以用一步法測定的是血清總甘油酯(定義為TG和游離甘油及少量甘油二酯、甘油一酯之和，習慣統稱為TG)，使反應結果不能真實反映血清中TG的含量。中華醫學會檢驗分會于1995年推薦GPO-PAP法的兩步酶法作為血清TG常規測定方法。該方法是將原單一的反應試劑分成雙試劑，其中LPL和4-氨基安替比林組成試劑Ⅱ，其余成分組成試劑Ⅰ，希望能減少游離甘油的干擾。按中華醫學會推薦法配制，其試劑II每升Tris-HCl緩沖液內含有主要成分有：Tris?0.15mmol(pH7.6)、LPL?30000U、4-氨基安替比林1.0mmol。試劑I：每升Tris-HCl緩沖液內含Tris?0.15mmol(pH7.6)、2，4-二氯酚3.0mmol、MgSO₄12mmol、膽酸鈉4.2mmol、Triton?X-1000.12g、ATP1.2mmol、GK?600U、GPO?3600U、POD?1200U。

國內大部分臨床實驗室采用一步酶法和兩步酶法檢測甘油三脂。國內一些試劑廠家生產兩步酶法的試劑盒是以GK、GPO、POD、2，4-二氯酚為試劑I，以LPL、4-氨基安替比林作為試劑Ⅱ。也有的廠家以GK、GPO、2，4-二氯酚為試劑I，以LPL、4-氨基安替比林和POD作為試劑Ⅱ。這些試劑盒既可以作為雙試劑使用，也可以將兩種試劑合在一起作為單試劑使用。中華醫學會推薦的兩步酶方法可以消除脂血、溶血、黃疽的干擾等優點，但在實際應用中也存在以下問題：