[發(fā)明專利]基于重組表達流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶的真核細胞凝集反應(yīng)的流感病毒抗體檢測方法

有效

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• 申請日: 2010-09-28
• 公開（公告）號: CN102023214A
• 公開（公告）日: 2011-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王革非;李蕊;李康生
• 申請（專利權(quán)）人: 汕頭大學醫(yī)學院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;C12N15/44;C12N15/55;C12N15/85;C12N15/79
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于重組表達流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶的真核細胞凝集反應(yīng)的流感病毒抗體的檢測方法。

背景技術(shù)

特定血清型流感病毒感染、感染后恢復(fù)、隱性感染、以及疫苗接種的人或動物，在其體液(如血清、支氣管灌洗液、血漿、組織液等)中會出現(xiàn)流感病毒血凝素抗體，通過檢測特定血清型流感病毒的抗體，可以判斷、診斷或確診該人或該動物是否感染(包括早期感染、隱性感染或感染后恢復(fù)等)該特定血清型的流感病毒、或接種過流感病毒疫苗、或評價其對特定血清型流感病毒的抵抗力等。

目前檢測待檢樣品中是否存在某一特定血清型的流感病毒抗體的方法，主要有血凝抑制實驗(HAI)和中和實驗，即將某一特定血清型的流感病毒先與待檢樣品混合，然后加入紅細胞或敏感細胞中，判斷待檢樣品是否能夠抑制該病毒的血凝反應(yīng)或細胞病變效應(yīng)來進行判定，其缺點是需要使用具有感染性的病毒，安全性存在隱患。在涉及病毒的實驗中，根據(jù)國家有關(guān)法規(guī)(國務(wù)院《病原微生物實驗室生物安全管理條例》、衛(wèi)生部《人間傳染的病原微生物名錄》、《人間傳染的高致病性病原微生物實驗室和實驗活動生物安全審批管理辦法》)及WHO的規(guī)定與建議，包括人H2N2以及部分禽流感病毒的操作要求在BSL-III(P3)實驗室進行，因此，上述方法的開展對實驗室條件要求很高，不適用于現(xiàn)場檢測和規(guī)模檢測。文獻也有報道，利用表達流感病毒HA的假病毒顆粒來代替具有感染性的流感病毒進行HAI實驗，但技術(shù)過于復(fù)雜。

上述方法的缺點還在于只能檢測流感病毒HA的抗體。流感病毒表面主要存在著2種抗原性較強的糖蛋白刺突，即血凝素NA和神經(jīng)氨酸酶NA，當流感病毒感染或隱性感染或接種疫苗后，人或動物的機體會針對HA和NA都產(chǎn)生抗體，正是如此，流感病毒中的甲型流感病毒根據(jù)HA的抗原性分為H1-H16等16個亞型，NA的抗原性分為N1-N9等9個亞型，在甲型流感病毒中根據(jù)HA和NA亞型的不同組合方式形成了眾多亞型，如H5N1(即H5亞型與N1亞型組合)。因此，如檢測流感病毒抗體，除需檢測HA血清型外，還需要對NA血清型進行檢測。而目前對NA血清型抗體的檢測則需要另行通過神經(jīng)氨酸酶酶活抑制的方法進行檢測。

除經(jīng)典的HAI和中和實驗外，也有用ELISA方法和乳膠凝集實驗方法來進行檢測的報道。ELISA和乳膠凝集的優(yōu)勢在于可以檢測HA和NA的抗體。其中，ELISA方法是利用重組表達和純化的流感病毒HA和/或NA來檢測相應(yīng)的抗體，這需要獲保持抗原特異性的重組蛋白的表達與純化，且由于流感病毒有眾多亞型，即使同種亞型的血清交叉反應(yīng)強度不一，對不同血清型的HA和NA抗原都進行重組蛋白的表達與純化，其工作量大、工藝要求高、批間穩(wěn)定性差。乳膠凝集方法相對于現(xiàn)有的其它方法(HAI、中和實驗以及ELISA方法)而言，反應(yīng)時間短、適合現(xiàn)場檢測，但仍存在一些不足。乳膠凝集實驗方法是將重組表達和純化的流感病毒HA和/或NA蛋白偶聯(lián)在惰性乳膠顆粒表面，利用凝集反應(yīng)進行檢測流感病毒相應(yīng)的抗體，這同樣需要重組表達和純化的流感病毒HA和NA，并需要獲得保持抗原特異性的重組蛋白的表達與純化，如需要檢測不同血清型的流感病毒HA和NA抗體，就需要對不同毒株的HA和NA進行重組表達和純化，與ELISA方法一樣，存在工作量大、工藝要求高、批間穩(wěn)定性差等問題。

由于檢測流感病毒抗體對人或該動物是否感染(包括早期感染、隱性感染或感染后恢復(fù)等)該特定血清型的流感病毒、或接種過流感病毒疫苗、或評價其對特定血清型流感病毒的抵抗力等有重要意義，而目前的HAI、中和實驗、ELISA以及乳膠凝集等檢測手段，或需要使用具有感染性的病毒，或需要特定的實驗條件和設(shè)備，或工藝復(fù)雜，或檢測耗時長等缺點，因此，一種簡便、快速、工藝相對簡單易控的，可以同時檢測流感病毒HA和NA抗體檢測方法具有廣泛的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中用于檢測流感病毒抗體的方法中存在的工藝復(fù)雜、檢測耗時長、穩(wěn)定性差等問題，提供一種快速、簡便、穩(wěn)定性好的基于重組表達流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶的真核細胞凝集反應(yīng)的流感病毒抗體的檢測方法。

本方法上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

本發(fā)明方法是將流感病毒血凝素基因和神經(jīng)氨酸酶基因克隆后轉(zhuǎn)染真核細胞，使真核細胞表面重組表達流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白，與待檢樣品中的流感病毒血凝素抗體和神經(jīng)氨酸酶抗體結(jié)合，發(fā)生凝集反應(yīng)，根據(jù)是否發(fā)生凝集反應(yīng)來檢測待檢樣品中的流感病毒抗體