[發(fā)明專利]一種制備β-甘露聚糖酶的方法及專用菌株

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010297135.0
• 申請(qǐng)日: 2010-09-29
• 公開（公告）號(hào): CN102433267A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬延和;朱泰承;游麗金;李寅;薛燕芬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N15/56;C12N9/42;C12N15/63;C12R1/84
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種制備β-甘露聚糖酶的方法及專用菌株。

背景技術(shù)

β-甘露聚糖酶(β-1，4-D-mannan?mannohydrolase；EC31211178)是一類降解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖的主鏈β-1，4-D-甘露吡喃糖的酶，它在利用現(xiàn)存在于一些植物如干椰子肉的胚乳、象牙棕櫚樹的堅(jiān)果、瓜爾豆、洋槐、咖啡樹以及魔芋的塊莖中的各種β-甘露聚糖有著潛在的重要性。國(guó)內(nèi)外現(xiàn)主要用于造紙工業(yè)紙漿的漂白、油井的破膠、降解植物膠生產(chǎn)低聚糖用作雙歧桿菌促生長(zhǎng)因子，防病抗衰老的保健食品以及飼料工業(yè)中作為抗?fàn)I養(yǎng)因子。

β-甘露聚糖酶按其最適pH值的不同有酸性、中性、堿性之分，其中堿性β-甘露聚糖酶是指在堿性條件下催化活力最高的β-甘露聚糖酶，其研究相對(duì)較晚，發(fā)現(xiàn)主要由嗜堿芽孢桿菌產(chǎn)生，某些地衣芽孢桿菌也產(chǎn)生堿性β-甘露聚糖酶，如楊文博等報(bào)道了一株地衣芽孢桿菌NK-27，其最適pH值為9.0。一般情況下枯草芽孢桿菌，放線菌等產(chǎn)生中性β-甘露聚糖酶，而霉菌產(chǎn)生酸性β-甘露聚糖酶。第一個(gè)堿性甘露聚糖酶由Akino等發(fā)現(xiàn)。馬延和等于1991報(bào)道了嗜堿芽孢桿菌N16-5的三個(gè)胞外堿性甘露聚糖酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)，并于2004年報(bào)道了其中一種嗜堿甘露聚糖酶的基因序列。Takeda等于2004年發(fā)現(xiàn)了芽孢桿菌屬的一個(gè)菌株JAMB-602產(chǎn)堿性甘露聚糖酶，此酶屬于GH家族5，最適pH為9。目前所發(fā)現(xiàn)的嗜堿甘露聚糖酶的最適pH值最高為10，由Takeda等于2004年報(bào)道。

堿性β-甘露聚糖酶不僅可以生產(chǎn)用作雙歧桿菌促生長(zhǎng)因子的低聚糖，而且在需堿性環(huán)境的紙漿漂白等工業(yè)方面具有廣泛的應(yīng)用前景。但到目前為止，堿性β-甘露聚糖酶的制備仍舊是限制其工業(yè)應(yīng)用的瓶頸，前人的報(bào)道中無(wú)論是使用堿性β-甘露聚糖酶的原產(chǎn)菌株還是使用重組菌株生產(chǎn)，其產(chǎn)量都比較低。

馬延和等于1991報(bào)道了嗜堿芽孢桿菌N16-5的三個(gè)胞外堿性甘露聚糖酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)，并于2004年報(bào)道了其中一種嗜堿甘露聚糖酶的基因序列，其基因的編碼區(qū)序列如SEQ?ID?NO：1中第7-1407位所示。

PTM₁溶液：將Cu?SO₄·5H₂O?6g，KI?0.08g，MnSO₄?2.68g，H₃BO₃?0.02g，Na₂MoO₄·2H₂O?0.2g，ZnSO₄·7H₂O?20g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O?65g，CoCl₂·6H₂O?0.916，H₂SO₄5mL，生物素0.2g混合，用水定容至1升，得到PTM₁溶液。

每1升BMGY液體培養(yǎng)基按照如下方法制備：將8克-12克或10克酵母提取物、18克-22克或20克蛋白胨、12克-15克或13.4克YNB、3×10^-4克-5×10^-4克或4×10^-4克生物素和8克-12克或10克甘油溶于水中，用水定容至1升，得到BMGY液體培養(yǎng)基。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種重組菌。

本發(fā)明所提供的重組菌，是將β-甘露聚糖酶的編碼基因?qū)氤霭l(fā)菌株，得到的重組菌；所述β-甘露聚糖酶的編碼基因序列如SEQ?ID?NO：1中第7-1407位核苷酸所示。

上述重組菌中，所述β-甘露聚糖酶的編碼基因是通過(guò)重組載體導(dǎo)入出發(fā)菌株的；所述重組載體為如下(1)或(2)或(3)所示：

(1)將SEQ?ID?NO：1所示DNA片段插入pAO815alpha的XhoI和EcoRI酶切位點(diǎn)間，得到的重組載體，記作pAOα-1sman；其中，XhoI酶切位點(diǎn)位于SEQ?ID?NO：1所示DNA片段的5′端上游，EcoRI酶切位點(diǎn)位于SEQ?ID?NO：1所示DNA片段的3′端下游；

(2)用BamHI/BglII雙酶切pAOα-1sman，回收2932bp片段；用BamHI單酶切pAOα-1sman，回收載體大片段；將所述2932bp片段和所述載體大片段連接，得到的重組載體，記作pAOα-2sman；