[發明專利]一種制備β-甘露聚糖酶的方法及專用菌株

有效

• 申請號: 201010297135.0
• 申請日: 2010-09-29
• 公開（公告）號: CN102433267A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發明（設計）人: 馬延和;朱泰承;游麗金;李寅;薛燕芬
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/56;C12N9/42;C12N15/63;C12R1/84
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

1.一種重組菌，是將β-甘露聚糖酶的編碼基因導入出發菌株，得到的重組菌；所述β-甘露聚糖酶的編碼基因序列如SEQ?ID?NO：1中第7-1407位核苷酸所示。

2.根據權利要求1所述的重組菌，其特征在于：所述β-甘露聚糖酶的編碼基因是通過重組載體導入出發菌株的；所述重組載體為如下(1)或(2)或(3)所示：

(1)將SEQ?ID?NO：1所示DNA片段插入pAO815alpha的XhoI和EcoRI酶切位點間，得到的重組載體，記作pAOα-1sman；其中，XhoI酶切位點位于SEQ?ID?NO：1所示DNA片段的5′端上游，EcoRI酶切位點位于SEQ?ID?NO：1所示DNA片段的3′端下游；

(2)用BamHI/BglII雙酶切pAOα-1sman，回收2932bp片段；用BamHI單酶切pAOα-1sman，回收載體大片段；將所述2932bp片段和所述載體大片段連接，得到的重組載體，記作pAOα-2sman；

(3)用BamHI/BglII雙酶切pAOα-2sman，回收5864bp片段；用BamHI單酶切pAOα-2sman，回收載體大片段；將所述5864bp片段和所述載體大片段連接，得到的重組載體，記作pAOα-4sman；

所述pAO815alpha按照如下方法得到：將載體pPICZα用SacI/EcoRI雙酶切，收集1000bp片段；用SacI/EcoRI雙酶切載體pAO815，回收載體大片段；將所述1000bp片段和所述載體大片段連接，得到的重組載體即為pAO815alpha；

所述出發菌株為酵母菌，優選為畢赤酵母菌，再優選為巴斯德畢赤酵母菌株GSl15。

3.根據權利要求1或2所述的重組菌，其特征在于：所述重組菌為巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)GS4SMAN，其保藏編號為CGMCC?NO.4095。

4.一種制備β-甘露聚糖酶的方法，包括如下步驟：將權利要求1-3中任一所述重組菌接種于發酵培養基中，發酵培養，得到β-甘露聚糖酶；將發酵容器內的所有物質記作發酵體系。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述發酵培養基為用于培養畢赤酵母菌的培養基，且其中含有甘油；

所述發酵培養依次按照如下三個階段進行：

階段一：包括如下步驟：從接種開始培養至發酵體系中的甘油耗盡；

階段二：包括如下步驟：在發酵體系中的甘油耗盡時，開始流加甘油或甘油溶液，培養至發酵體系的OD₆₀₀值達到200-350或200或250或320或350，停止流加甘油或甘油溶液；

階段三：為如下1)或2)所示：

1)包括如下步驟：在發酵體系中的甘油耗盡時，向發酵體系中加入山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液，進行誘導表達；

2)包括如下步驟：在發酵體系中的甘油耗盡時，將發酵體系的溫度調至26℃～29℃或26℃或27℃或28℃或29℃，向發酵體系中加入山梨醇與甲醇的混合水溶液或甲醇或甲醇溶液，進行誘導表達；

所述甘油溶液由甘油、PTM₁溶液和水組成；所述甲醇溶液由甲醇、PTM₁溶液和水組成。

6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述山梨醇與甲醇的混合水溶液中，山梨醇與甲醇的質量比為1∶20～1∶5或1∶20或1∶10或1∶5。

7.根據權利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：所述山梨醇與甲醇的混合水溶液中，山梨醇的濃度為36g/L-144g/L或36g/L或72g/L或144g/L，甲醇的濃度為720g/L。

8.根據權利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于：所述階段一和所述階段二中的培養在pH值為6.0、溫度為30℃、溶氧為30％以上的條件下進行；

所述階段三中的1)中，誘導表達在pH值為6.0、溫度為30℃、溶氧為30％以上的條件下進行；

所述階段三中的2)中，誘導表達在pH值為6.0、溫度為26℃～29℃或26℃或27℃或28℃或29℃、溶氧為30％以上的條件下進行。