[發明專利]一種胰島素和C肽雙標記測定試劑盒

無效

• 申請號: 201010296346.2
• 申請日: 2010-09-28
• 公開（公告）號: CN102419373A
• 公開（公告）日: 2012-04-18
• 發明（設計）人: 李明;湯永平;吳英松;徐偉文;朱坤
• 申請（專利權）人: 廣州市達瑞抗體工程技術有限公司
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74;G01N33/577;G01N21/64
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技術領域

本發明涉及一種胰島素和C肽雙標記試劑盒，特別是涉及一種以濾紙干血片為樣本使用雙標記時間分辨免疫熒光法進行胰島素和C肽測定的試劑盒，利用本試劑盒一次測試可以同時定量檢測胰島素和C肽兩種標志物。本發明試劑盒的應用解決了血清樣本中胰島素和C肽不穩定的問題，可廣泛用于糖尿病的輔助診斷和病情檢測，指導臨床用藥以及預后等多個研究領域。

背景技術

糖尿病(DM)是一種常見多發病，也是世界衛生組織所列三大疑難病之一，如何防治DM是現代醫學界的一大難題.DM分為I型(胰島素依賴型)和II型(非胰島素依賴型)，其實驗室分型依據主要依賴胰島素及C肽釋放試驗。

胰島素及C肽釋放試驗即在做口服葡萄糖耐量試驗的同時，利用口服葡萄使血糖升高而刺激胰島B細胞分泌胰島素，通過測定空腹及服糖后1小時、2小時、3小時血中胰島素和C肽動態變化，來反映胰島B細胞的功能狀況。

胰島素是從胰島B細胞分泌的一種能降低血糖的物質。胰島B細胞合成胰島素原后，分裂為胰島素及C肽，二者以同等的數目釋放入血循環中。測定血中胰島素及C肽濃度，可以了解胰島B細胞貯備功能，對指導治療具有非常重要的意義。對于那些已經使用外源性胰島素治療的糖尿病人，體內可產生胰島素抗體，干擾胰島素測定，而測定血中C肽水平不僅可以準確地反映B細胞功能，而且可以彌補胰島素測定的不足。臨床上，常常將葡萄糖耐量試驗，胰島素及C肽釋放試驗同時檢測。

常規的血清胰島素和C肽檢測大多采用酶聯免疫法(ELISA)、化學發光法和時間分辨免疫熒光分析法(TRFIA)。

酶聯免疫法試劑盒均為半定量試劑，不能為臨床醫生提供精確的定量值，很難有效指導臨床的治療。同時，由于該方法本身在靈敏度上的局限性，對于血清胰島素和C肽含量的變化還無法有效檢測，影響了臨床醫生的判斷。

時間分辨免疫熒光分析技術(Time-resolved?fluoroimmunoassay，TRFIA)是繼放射免疫分析之后標記物發展的一個新里程碑，已成為生物醫學研究和臨床超微量生化檢驗中一項最有發展前景的分析手段。TRFIA以稀土離子作為標記物，具有制備簡便、儲存時間長、無放射性污染、重復性好、操作流程短、標準曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾和應用范圍十分廣泛等優點。因此，本發明選用TRFIA技術研制胰島素和C肽檢測試劑盒。

胰島素分子量5700道爾頓，由兩條氨基酸肽鏈組成，C肽是由21個氨基酸組成的直鏈，分子量3020道爾頓，均可以采用雙抗體夾心法進行檢測。

銪和釤是TRFIA技術中常用于雙標記分析中的一對稀土元素。他們的激發波長均為340nm，均能利用β-萘甲酰三氟丙酮(β-NTA)螯合劑增強熒光強度。銪和釤最大發射波長分別為613nm和643nm，雖然相差不大，但由于是窄峰發射，能夠充分分辨；另外銪和釤熒光壽命相差顯著，分別為820μs和88μs，檢測時彼此干擾比較小。本發明采用銪標記C肽抗體、釤標記胰島素抗體，利用TRFIA技術在一份樣本中同時定量測定胰島素和C肽，除了擁有TRFIA技術的固有特點外，還具有省時、經濟和高效等突出優點。

常規實驗方法以血清作為檢測樣本。而胰島素和C肽在血清中穩定性較差，特別是C肽。血清樣本(2-8)℃放置3天，胰島素和C肽濃度將下降10％以上。本發明采用濾紙干血片為載體，采集病人手指或足跟血，滴制血片，晾干。胰島素和C肽在濾紙干血片中(2-8)℃保存7天，活性無明顯下降。本發明采用濾紙干血片作為樣本，大大提高胰島素和C肽的檢測結果的穩定性，更適合于臨床應用。

本發明的試劑盒選用濾紙干血片為檢測樣本，并整合雙標記時間分辨熒光分析技術，具有靈敏度高、穩定性好、省時、高效等顯著優點。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用雙標記時間分辨免疫熒光分析技術同時進行胰島素和C肽定量測定的試劑盒。

為了實現本發明，需要對試劑盒所使用的原料進行篩選，從而確定最佳的原料，這一篩選過程包括包被和標記抗體的活性、標記物和抗體的比例、包被抗體的濃度、標記物的稀釋度、包被板的吸附性能和變異大小等。由于銪和釤的標記和純化方法與酶聯免疫分析完全不同，通過反復探索和試驗比對，最終找到了簡便、效率高、成本低、質量可靠的方法。

同時本發明通過研究確定了試劑盒的組分及配方，包括：洗液配方、分析緩沖液配方、增強液配方、校準品基質的配方等，并公開了銪和釤標記抗體的制備過程。

基于本發明目的，其中所述的試劑盒包括：

1)校準品干血片；

2)包被反應板；

3)標記物；