[發明專利]一種新型的選擇標記及其在植物遺傳轉化中的應用

無效

• 申請號: 201010296258.2
• 申請日: 2010-09-29
• 公開（公告）號: CN102021166A
• 公開（公告）日: 2011-04-20
• 發明（設計）人: 李海燕;范秀朵;陳靜;王南
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 長春市四環專利事務所 22103
• 代理人: 張鐵生

技術領域

本發明屬生物技術領域，確切地說是一種安全選擇標記及其在獲得轉基因植株中的應用。

背景技術

現階段轉基因技術效率較低，外源基因整合到目標生物基因組中的頻率通常為千分之幾至百萬分之幾。因此，目的基因的導入通常需要串聯易于識別的標記基因用于篩選轉化子，這種標記基因又稱為“選擇標記”或“篩選標記”，目前廣泛使用的選擇標記基因常常是一些顯性基因編碼抗生素或除草劑抗性基因(Yoder?and?Goldsbrough，1994)?？股鼗虺輨┠軞⑺婪寝D基因細胞，但抗性選擇標記基因中也存在著一些問題：(1)抗生素或除草劑的使用常常對轉化細胞的發育和分化產生負面的影響，可能會延遲不定芽的分化；(2)對于不敏感的品種，這些選擇試劑不能很好的區分轉化和非轉化細胞，因此不能起到應有的作用(Ebinuma?et?al.，1997)；(3)選擇標記因常常與目的基因一起整合到植物基因組中，對轉基因植株產生一系列不良的影響。大多數選擇標記基因為組成型表達這樣消耗了植株大量的生物能，對轉基因植株的生長和發育有負面的影響；(4)從健康及安全性角度考慮，抗性選擇標記基因表達產物在食物中存在可能被轉移到人或動物的腸道寄生菌中使其產生耐藥性，從而降低或喪失某種抗生素的治療作用(Zechendorf?B.1994.12：870～875)。若選擇性標記基因通過某種渠道發生漂流，可能導致生態平衡被破壞、自然生物種群發生改變(Dale?PJ.1992.Plant?Physiol.100：13～15)。

為了避免上述問題的發生，尋求安全的選擇標記基因成為轉基因技術研究的熱點。利用安全選擇標記基因建立的轉化系統通常不是將非轉化細胞殺死，而是使轉化細胞處于某種有利的代謝或發育條件，從而篩選出轉化體。這種方法的主要優點在于選擇劑無毒副作用，且在多數情況下有利于轉化體的再生，從而提高轉化效率。目前，主要的安全選擇標記有下述四類：

(1)有關糖代謝途徑的基因

已用于植物轉化的此類標記基因有6-磷酸甘露糖異構酶(phosphormnnaoes?isomerase，PMI)基因，木糖異構酶(xylose?isomeasre，XYIA)基因以及核糖操縱子。它們的作用原理基本相同，都是使在含有碳源的培養基上只有轉化細胞能正常生長，而非轉化細胞將被淘汰悼。

(2)代謝產物選擇標記

代謝產物選擇標記是一種新的篩選標記，這種標記是把外源的功能基因轉入受體并在受體中得到表達，從而利用其特有的代謝產物進行篩選。

(3)耐脅迫基因

此類標記基因和傳統的抗性標記基因的作用機制相似，屬于負選擇標記基因。其編碼產物可催化對細胞生長有毒的或有脅迫的化合物轉變成無毒且對生長有益的化合物，或保護細胞不受逆境傷害，從而使轉化細胞能在有毒或脅迫條件下生長，而非殺死轉化細胞。近年來，許多非生物抗逆基因，如抗鹽堿、干旱、低溫等基因相繼被發現并克降，其中耐鹽、耐旱基因研究較多，已分離克隆了幾十種基因。

(4)熒光標記基因

20世紀60年代，Shimomura等首次從多管水目屬(Aequorea?Victoria)中分離純化出一種熒光物質，并將其定性為蛋白質，稱之為綠色熒光蛋白(green?fluorescent?proteins，GFPs)，在一定波長的光子激發下，會發出強烈的熒光。其熒光的發生無需底物和輔助因子，表達產物對細胞無毒害作用，不影響細胞的正常生長和功能(趙華等，2003)。此外，還有一些GFP基因的突變體，包括黃色熒光蛋白基因(YFP)，青色熒光蛋白基因(CFP)和紅色熒光蛋白基因(RFP)等(Bajaj?and?Mohanty，2005)。

近年來，世界大豆需求量快速增長，然而大豆產量與品質受到干旱的極大制約，因而大豆抗旱育種成了大豆育種工作中的重點，研究表明大量逆境應答基因的表達為植物獲得抗逆性所必需(Gong?et?al.，PNAS，99：11507-11512)。揭示大豆對干旱的生理響應、適應性和抗旱遺傳機制有助于從生物節水途徑上提高大豆生產水平。研究基因干旱誘導表達的特異性，對揭示植物的發育以及植物與干旱環境互作的機制具有重要意義。隨著植物生理的抗旱分子生物學研究，人們逐漸確定了與抗旱性有關的重要基因，并進行了基因定位研究，取得了一定的進展。研究證實大豆Δ～1-pyrroline-5-carboxylate?synthetase(P5CS)基因的表達具有干旱誘導的特異性，該基因在積累脯氨酸以降低滲透脅迫、在正常和脅迫條件下反饋調控植物中脯氨酸合成水平等方面均起著重要作用。