[發明專利]表達雞α-干擾素的大腸桿菌及其應用

無效

• 申請號: 201010295927.4
• 申請日: 2010-09-29
• 公開（公告）號: CN101974477A
• 公開（公告）日: 2011-02-16
• 發明（設計）人: 馬鳳龍;崔增學;李春榮;劉煥珍;石喬
• 申請（專利權）人: 崔增學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/21;C12P21/02;A61K38/21;A61K9/08;A61P31/14;C12R1/91
• 代理公司: 北京康盛知識產權代理有限公司 11331
• 代理人: 張良

技術領域

本發明涉及一種表達雞α-干擾素的大腸桿菌及其應用。

背景技術

家禽腫瘤和病毒感染性疾病的有效治療一直是困擾禽病防治的重大難題之一。雞的免疫系統以及在病原感染或注射疫苗時所產生的免疫反應與哺乳動物相似，所以可考慮應用細胞因子來控制疾病。相對來說，禽類的飼養簡單、廉價，出籠時間短，而且數量較大，這就需要考慮所用疫苗或者治療藥物的經濟價值。綠色食品工程的啟動，人們對食品安全重視的升溫，常用的抗病毒類藥物帶來嚴重的藥物殘留，危及人類的健康，得到社會的普遍關注。所以，養禽業迫切需要新一代天然治療方法。在病原感染和疫苗免疫中，干擾素等細胞因子可調控免疫反應的類型與程度，是一種高效、天然的治療方法。干擾素是第一個應用于臨床的基工程產品，目前IFN-α、IFN-β和IFN-γ都有基因工程產物，在臨床醫學中有40多個國家使用干擾素制劑，治療30多種疾病，但主要是用于臨床腫瘤和病毒感染等治療。與之相類似，IFN在家禽腫瘤和病毒性疾病的臨床治療上也有極其廣泛的應用前景。

發明內容

本發明的目的是提供一種遺傳穩定、重組蛋白表達穩定的表達雞α-干擾素的重組菌。

本發明所提供的表達雞α-干擾素的重組菌，是穩定表達序列表中序列1第94-582位所示的DNA分子編碼的蛋白的重組大腸桿菌。

其中，所述大腸桿菌可以為大腸桿菌菌株M15[pREP4]。

本發明的表達雞α-干擾素的重組菌在有選擇壓力下經過傳代培養重組菌含質粒率均在96％以上，在無選擇壓力下連續傳代5代時質粒丟失率小于5％，經誘導表達后，目的蛋白表達量穩定，復性后蛋白的抗病毒活性均在2.18×10⁹U/mg以上。本發明的表達雞α-干擾素的重組菌對雞是安全的。

本發明的另一個目的是提供一種生產雞α-干擾素蛋白的方法。

本發明的生產雞α-干擾素蛋白的方法，包括如下步驟：

將上述表達雞α-干擾素的重組菌進行培養，誘導表達雞α-干擾素，收集菌體，破碎菌體，離心收集包涵體，洗滌包涵體，離心收集包涵體；

用含有5-8mol/L鹽酸胍的緩沖溶液溶解包涵體，離心收集上清；

采用His-蛋白質鎳親和層析樹脂純化上清，收集目的蛋白峰；

測定收集的蛋白濃度，在冰水浴或者2℃-8℃的條件下，將收集的蛋白加入到復性液中使蛋白質濃度在75-150μg/mL?L，2℃-8℃靜置復性20-24小時，獲得豬α-干擾素蛋白；所述復性液中鹽酸胍0.3-1.0mol/L、尿素0.5-2.0mol/L、精氨酸0.1-1.0mol/L、還原型半胱氨酸1.0-7.0mmol/L、氧化型胱氨酸0.1-2.0mmol/L、Tris-HCl?10-20mmol/L(pH8-11)、EDTA?1.0-5.0mmol/L(pH8.0)；

采用離子柱對上述復性后的溶液進行純化、透析，獲得雞α-干擾素蛋白。

本發明的生產雞α-干擾素蛋白的方法獲得的α-干擾素蛋白能夠有效地抑制VSV病毒對細胞的破壞作用，生物學活性均在2.18×10⁹U/mg以上。

本發明的再一個目的是提供一種雞α-干擾素蛋白注射液。

本發明所提供的雞α-干擾素蛋白注射液，其活性成分為上述生產雞α-干擾素蛋白的方法制備的雞α-干擾素蛋白的PBS溶液或者生理鹽水溶液。

其中，還可含有適宜濃度的佐劑、穩定劑。如濃度為0.1～0.5mol/L的精氨酸、1～10％的葡萄糖或蔗糖，0.1～2.5％的甘露醇或山梨醇及適量濃度的甘油、氯化鈉等。

本發明的雞α-干擾素蛋白注射液，對雞是安全的，并且提高了肉仔雞的生產性能，提高了肉仔雞的胴體品質，提高了機體的吸收能力，增強了雞的機體抵抗力。對提高肉仔雞的淋巴細胞免疫功能、具有一定促進作用；同時對肉仔雞免疫器官的發育有一定的促進作用，也能增強雞機體巨噬細胞功能；對臨床型雞ND具有明顯的治療效果。

附圖說明

圖1為ChIFN-α基因PCR產物電泳結果。

圖2為重組雞IFN-α的標準曲線。

圖3為雞體內基因工程α-干擾素的藥時曲線。

圖4為使用重組雞IFN-α對肉雞免疫器官的影響。

圖5為胸腺、脾臟、法氏囊和肝臟的組織切片。

具體實施方式

實施例

(一)雞IFN-α基因的克隆及在大腸桿菌中的高效表達與復性

菌種：大腸桿菌JM109，宿主表達菌M15(pREP4)，購自QIAGEN公司。