[發(fā)明專利]魚類染色體熒光原位雜交方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010293726.0
• 申請日: 2010-09-28
• 公開（公告）號: CN101974622A
• 公開（公告）日: 2011-02-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李雅娟;魏杰;張東升;于卓;張明昭;錢聰
• 申請（專利權(quán)）人: 大連海洋大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 大連非凡專利事務(wù)所 21220
• 代理人: 閃紅霞

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種魚類染色體熒光原位雜交方法，特別是一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、定位準(zhǔn)確，有利于分析多倍體魚類是遺傳多倍體，還是進(jìn)化多倍體，以及是同源多倍體還是異源多倍體的魚類染色體熒光原位雜交方法。

背景技術(shù)：

在水產(chǎn)動物中，自然多倍體現(xiàn)象比較普遍。在中國已報道的淡水魚類核型中有多種魚發(fā)現(xiàn)了多倍體類型。多倍體魚類因其生長優(yōu)勢、群體產(chǎn)量及抗病力等各方面都具有二倍體魚所無法比擬的優(yōu)勢，因此，許多多倍體種類已成為重要的經(jīng)濟(jì)魚類或重要的養(yǎng)殖對象。目前，關(guān)于魚類染色體數(shù)目和核型的研究已有相應(yīng)文獻(xiàn)報道，如我國常見的泥鰍，李渝成(1987)和印杰(2005)等根據(jù)染色體的基本形態(tài)學(xué)特征對泥鰍染色體中期分裂相進(jìn)行核型分析，二倍體泥鰍2n＝50，核型公式8m+6sm+36t，NF＝64；四倍體泥鰍4n＝100，核型公式16m+12sm+72t，NF＝128，類似的研究在我國廣布的鯉科寬鰭和鱧科的月鱧(李渝成1985)等，均有所報道。但由于缺少足夠的遺傳學(xué)證據(jù)，染色體核型分析通常只能以二倍體的形式排列，即不能分析出多倍體魚類是遺傳多倍體，還是進(jìn)化多倍體，以及是同源多倍體還是異源多倍體。

熒光原位雜交(Fluorescence?in?situ?hybridization?FISH)是一門新興的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，是20世紀(jì)80年代末期在原有放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù)。FISH技術(shù)彌補(bǔ)了經(jīng)典原位雜交和染色體帶型技術(shù)的不足，可以在分子水平上進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)分析。它具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、定位準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于基因診斷、基因組作圖和基因定位、核組成、染色體機(jī)構(gòu)與功能、染色體進(jìn)化、染色體鑒別等多個方面，已經(jīng)成為分子細(xì)胞遺傳學(xué)發(fā)展最快的領(lǐng)域。FISH技術(shù)在人類及哺乳動物中已成功運(yùn)用，但在魚類遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用還不夠深入廣泛，應(yīng)用報道很少，如戢福云等人(2003)應(yīng)用FISH技術(shù)證明黃鱔中存在Hsl基因；易梅生等人(2002)應(yīng)用FISH技術(shù)將人類Y染色體長臂異染色質(zhì)區(qū)與魚類基因組進(jìn)行比較。迄今為止，關(guān)于FISH技術(shù)在魚類多倍體方面的應(yīng)用未見報道。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、定位準(zhǔn)確，有利于分析多倍體魚類是遺傳多倍體，還是進(jìn)化多倍體，以及是同源多倍體還是異源多倍體的魚類染色體熒光原位雜交方法。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：一種魚類染色體熒光原位雜交方法，其特征在于依次按如下步驟進(jìn)行：

a.制備染色體分散良好的染色體玻片標(biāo)本，-80℃保存；

b.將染色體玻片標(biāo)本于65℃恒溫干燥2小時，在4×SSC溶液中浸泡5min，取0.5mg/ml的RNase溶液100μL至染色體玻片標(biāo)本上，用封口膜蓋上載玻片，放入底部放有2×SSC溶液的濕盒中37℃，30min；然后揭掉封口膜，將染色體玻片標(biāo)本放入4×SSC溶液中浸泡5min，再轉(zhuǎn)入裝有卡諾固定液的染色缸中浸泡5min后取出、晾干；所述2×SSC溶液是DDW與20×SSC溶液體積比為9∶1的混合液，所述4×SSC溶液是DDW與20×SSC溶液體積比為4∶1的混合液；

c.以人的5.8S+28SrDNA為探針，用Biotin-16-dUTP標(biāo)記該探針，探針標(biāo)記混合液渦流振蕩混合輕離心后，15℃水浴120min，65℃10min，室溫放置10min后4℃冷藏；純化混合液與探針標(biāo)記混合液按體積比為70.5∶20混合，-80℃靜置20min，室溫靜置10min，4℃15000rpm離心15min，加入150μL70％酒精輕離心，去掉上清液室溫干燥5min，加入去離子甲酰胺20μL，得純化后的探針混合液冷藏備用；所述探針標(biāo)記混合液組成為：0.4mol/ml?dATP2μL，0.4mol/ml?dGTP2μL，0.4mol/ml?dCTP?2μL，10×buffer?2μL，1mol/ml?Biotin-16-dUTP?1μL，100μg/ml人的5.8S+28S?rDNA探針1μL，滅菌蒸餾水6.5μL，DNA聚合酶I和DNA酶混合液3.5μL；所述純化混合液是鮭魚精子DNA和E.coli體積比為1∶1的混合液2μl、4mol/ml的醋酸銨2.5μL及100％酒精66μL的混合液；

d.將c步驟冷藏備用的純化后的探針混合液在75℃的水浴鍋中10min，迅速置于冰盒中冷卻10min；