[發明專利]魚類染色體熒光原位雜交方法

有效

• 申請號: 201010293726.0
• 申請日: 2010-09-28
• 公開（公告）號: CN101974622A
• 公開（公告）日: 2011-02-16
• 發明（設計）人: 李雅娟;魏杰;張東升;于卓;張明昭;錢聰
• 申請（專利權）人: 大連海洋大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 閃紅霞

1.一種魚類染色體熒光原位雜交方法，其特征在于依次按如下步驟進行：

a.制備染色體分散良好的染色體玻片標本，-80℃保存；

b.將染色體玻片標本于65℃恒溫干燥2小時，在4×SSC溶液中浸泡5min，取0.5mg/ml的RNase溶液100μL至染色體玻片標本上，用封口膜蓋上載玻片，放入底部放有2×SSC溶液的濕盒中37℃，30min；然后揭掉封口膜，將染色體玻片標本放入4×SSC溶液中浸泡5min，再轉入裝有卡諾固定液的染色缸中浸泡5min后取出、晾干；所述2×SSC溶液是DDW與20×SSC溶液體積比為9∶1的混合液，所述4×SSC溶液是DDW與20×SSC溶液體積比為4∶1的混合液；

c.以人的5.8S+28SrDNA為探針，用Biotin-16-dUTP標記該探針，探針標記混合液渦流振蕩混合輕離心后，15℃水浴120min，65℃10min，室溫放置10min后4℃冷藏；加入純化混合液，純化混合液與探針標記混合液的體積比為70.5∶20，-80℃靜置20min，室溫靜置10min，4℃15000rpm離心15min，加入150μL70％酒精輕離心，去掉上清液室溫干燥5min，加入去離子甲酰胺20μL，得純化后的探針混合液冷藏備用；所述探針標記混合液組成為：0.4mol/ml?dATP2μL，0.4mol/ml?dGTP2μL，0.4mol/ml?dCTP?2μL，10×buffer?2μL，1mol/mlBiotin-16-dUTP?1μL，100μg/ml人的5.8S+28S?rDNA探針1μL，滅菌蒸餾水6.5μL，DNA聚合酶I和DNA酶混合液3.5μL；所述純化混合液是鮭魚精子DNA和E.coli體積比為1∶1的混合液2μl、4mol/ml的醋酸銨2.5μL及100％酒精66μL的混合液；

d.將c步驟冷藏備用的純化后的探針混合液在75℃的水浴鍋中10min，迅速置于冰盒中冷卻10min；

e.將b步驟所得染色體玻片標本放入含70％甲酰胺/2×SSC溶液中，于70℃水浴2min，迅速移入-20℃預冷70％酒精的染色缸內10min，再移入100％的-20℃預冷酒精內5min，空氣干燥；

f.將雜交混合液加入到經d步驟處理的純化后的探針混合液中，體積比5∶12，渦流振蕩混合輕離心，37℃恒溫培養箱內預雜交30min后，再將其滴在染色體玻片標本上，蓋上封口膜，放在2×SSC溶液濕盒中，37℃恒溫培養箱內至少18h；所述雜交混合液是20mg/ml的BSA、20×SSC溶液、滅菌蒸餾水及50％硫酸葡聚糖的體積比為1∶1∶1∶2的混合液；

g.揭掉封口膜洗脫，洗脫過程為經50％甲酰胺/2×SSC溶液中42℃水浴鍋中20min→2×SSC溶液室溫20min→1×SSC溶液室溫20min→4×SSC溶液室溫5min；所述1×SSC是DDW與20×SSC體積比為19∶1的混合液；

h.取出染色體玻片標本用吸水紙將沒有染色體的部分擦干，在有染色體范圍內滴入100μL10μg/ml檢測試劑混合液，蓋上封口膜，放在2×SSC溶液濕盒中，37℃恒溫培養箱避光1h，揭掉封口膜，在水平往復搖床上按以下過程避光洗脫：0.1％Triton/4×SSC溶液20min→4×SSC溶液5min→4×SSC溶液5min；取出染色體玻片標本用吸水紙將沒有染色體的部分擦干，在有染色體范圍內滴入100μL10μg/ml信號放大混合液，蓋上封口膜，放在2×SSC溶液濕盒中，37℃恒溫培養箱避光培育1h，揭掉封口膜，在水平往復搖床上按以下過程避光洗脫：0.1％Triton/4×SSC溶液20min→4×SSC溶液5min→4×SSC溶液5min；再取出染色體玻片標本用吸水紙將沒有染色體的部分擦干，在有染色體范圍內滴入100μL10μg/ml檢測試劑混合液，蓋上封口膜，放在2×SSC溶液濕盒中，37℃恒溫培養箱避光1h，揭掉封口膜，在水平往復搖床上按以下過程避光洗脫：0.1％Triton/4×SSC溶液20min→4×SSC溶液5min→4×SSC溶液5min；所述10μg/ml檢測試劑混合液是用1％BSA/4×SSC配置的含10μg/ml的avidin-FITC溶液，所述信號放大混合液是用1％BSA/4×SSC配置的含10μg/ml的biotin/anti-avidin溶液；

i.把染色體玻片標本放在2×SSC溶液中清洗5min，用吸水紙吸去染色體玻片標本表面多余的2×SSC溶液，在有染色體處滴入50μL2.5μg/ml的DAPI熒光染液，蓋上蓋玻片并封片，平放在載玻片夾中4℃冷藏；所述DAPI熒光染液是母液、緩沖液和DABCO體積比為1∶5∶15的混合液，所述母液是將10mgDAPI溶在1000ml的蒸餾水中，所述緩沖液的組成為：0.12414gTris、0.37225g?EDTA-2Na及0.5844gNaCl溶于100ml蒸餾水中。