[發(fā)明專利]人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的聚乙二醇化學(xué)修飾物及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010291928.1
• 申請(qǐng)日: 2010-09-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102406943A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-04-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃志峰;李校堃;王會(huì)巖;王曉杰;馮文科;陸美斐;倪春燕;孫傳傳;葉朝輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 溫州醫(yī)學(xué)院;浙江格魯斯特生物科技有限公司
• 主分類號(hào): A61K47/48
• 分類號(hào): A61K47/48;A61K38/18;A61P3/10
• 代理公司: 溫州甌越專利代理有限公司 33211
• 代理人: 李友福

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)修飾物領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及用聚乙二醇修飾的人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的修飾產(chǎn)物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast?growth?factor，簡(jiǎn)稱為FGF）-21是FGF家族的一個(gè)新成員，是一種分泌蛋白，最早從鼠胚胎中分離出來(lái)。人的FGF-21cDNA編碼209個(gè)氨基酸，與鼠的FGF-21的氨基酸序列大約有75%的同源性。迄今為止FGF-21的生物活性作用方式主要體現(xiàn)在降低血糖、改善血脂方面（降低血糖的同時(shí)不導(dǎo)致低血糖），可用于治療Ⅱ型糖尿病，并且對(duì)藥物引發(fā)的早期肝癌有一定的治療作用，另外在胚胎發(fā)育中的也能起到一定作用。

FGF-21的廣泛的生物學(xué)活性表明其在醫(yī)療上有廣泛的應(yīng)用前景。但大量研究和臨床實(shí)踐表明FGF-21存在穩(wěn)定性差、體內(nèi)半衰期短以及存在免疫原性等缺陷。因此如何提高FGF-21穩(wěn)定性、延長(zhǎng)其體內(nèi)半衰期成為一個(gè)重要的課題。因此，美國(guó)禮來(lái)公司等利用聚乙二醇(polyethylene?glycol，簡(jiǎn)稱為PEG)來(lái)對(duì)FGF-21進(jìn)行修飾，用以提高FGF-21穩(wěn)定性、延長(zhǎng)其體內(nèi)半衰期（可參見(jiàn)WO2009020802A、WO2008011633A、WO2006091727A、WO2006050247A、WO2005091944A等）。但是這些技術(shù)多數(shù)屬于定點(diǎn)PEG化，甚至為了PEG化而突變FGF-21蛋白本身的氨基酸殘基，除了部分實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的意外，將導(dǎo)致突變后的FGF-21蛋白是否能具有原有功能的不可預(yù)料性。

然而，非定點(diǎn)PEG化蛋白質(zhì)盡管相對(duì)于定點(diǎn)PEG化蛋白質(zhì)的制備方式簡(jiǎn)單些，成本通常也較低，但是，PEG通過(guò)活性基團(tuán)與蛋白質(zhì)的末端或側(cè)鏈連接，理論上將造成蛋白質(zhì)本身折疊構(gòu)型的改變，因此，該蛋白質(zhì)經(jīng)PEG化是否仍舊具有原有蛋白功能并起相應(yīng)作用，是難以預(yù)料的。Harris等（Clinical?Pharmocokinetics，2001，40（7）：539-551）明確指出，PEG的大小、幾何特征和連接位點(diǎn)等均對(duì)最終PEG化的產(chǎn)物構(gòu)成關(guān)鍵的影響，有眾多因素可能影響蛋白質(zhì)的PEG化，包括但不限于：

??????1，不同的氨基酸序列所能提供的連接位點(diǎn)數(shù)目不同；

??????2，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可能會(huì)將連接位點(diǎn)包埋在內(nèi)部，從而在一定條件下的PEG化將使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)翻轉(zhuǎn)；

??????3，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可能會(huì)使PEG在連接位點(diǎn)處形成空間位阻，造成蛋白質(zhì)折疊的不可逆轉(zhuǎn)變；

??????4，可能在PEG化后破壞蛋白質(zhì)的配體-受體結(jié)合界面；

??????5，不同的PEG化模式可能導(dǎo)致不同程度的抗原性；

??????6，不同的PEG化模式可能導(dǎo)致不同的清除率；

??????7，不同的清除機(jī)制需要不同程度的PEG連接和/或不同的PEG連接位點(diǎn)；

??????8，不同的PEG化模式可能導(dǎo)致不同的半衰期以滿足蛋白質(zhì)在生理環(huán)境下發(fā)揮其功能的要求。

因此，蛋白質(zhì)的PEG化是不可預(yù)測(cè)的。另外，Clark等（Journal?of?Biological?Chemistry，?1996，?271（36）：21969-21977）也公開(kāi)了PEG化后蛋白質(zhì)功能的不可預(yù)測(cè)性的例證。

因此，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期努力，發(fā)現(xiàn)某些FGF-21的非定點(diǎn)PEG化模式將導(dǎo)致FGF-21本身的蛋白活性極大降低，甚至蛋白功能消失，而必須采用一些經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的FGF-21的非定點(diǎn)PEG化模式才能具有原有蛋白功能，不大幅降低原有蛋白活性，從而可以調(diào)節(jié)血糖、血脂代謝，用于實(shí)際的II型糖尿病等治療用途中。當(dāng)然，這些經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的FGF-21的非定點(diǎn)PEG化模式仍舊保留了PEG化本身的優(yōu)點(diǎn)，如熱穩(wěn)定性好、抗酶解能力高、體內(nèi)半衰期長(zhǎng)、免疫原性低和安全性好等。另外，這些經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的FGF-21的非定點(diǎn)PEG化模式，產(chǎn)物均一性好、分離純化工藝簡(jiǎn)單，尤其還可以方便地回收未與PEG綴合的FGF-21。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種熱穩(wěn)定性好、抗酶解能力高、體內(nèi)半衰期長(zhǎng)、免疫原性低和安全性好的FGF-21的修飾物，其不大幅降低原有未修飾的蛋白活性，從而具有FGF-21蛋白功能，可以調(diào)節(jié)血糖、血脂代謝。本發(fā)明另一個(gè)要解決的技術(shù)問(wèn)題還在于提供上述修飾物的制備方法，其產(chǎn)物均一性好、分離純化工藝簡(jiǎn)單，尤其還可以方便地回收未與PEG綴合的FGF-21。