[發明專利]用人羊膜間充質細胞作培養層來培養人源性人工誘導多潛能干細胞的方法

無效

• 申請號: 201010290415.9
• 申請日: 2010-09-25
• 公開（公告）號: CN102409022A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發明（設計）人: 李凌松;蔡哲;張可華
• 申請（專利權）人: 李凌松;蔡哲
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074
• 代理公司: 北京雙收知識產權代理有限公司 11241
• 代理人: 盧新

技術領域

本發明涉及了一種培養人源性人工誘導多潛能干細胞的方法，特別是用人羊膜間充質細胞作培養層來培養人源性人工誘導多潛能干細胞的方法。

背景技術

人胚胎干細胞(human?embryonic?stem?cell，hESC)最初由Thomson等于1998年從處于囊胚階段的早期胚胎中分離。通過分離人囊胚內細胞團，以35Gyγ射線照射的小鼠胚胎成纖維細胞(mouse?embryonic?fibroblast，MEF)作為培養層體外培養，約9-15天后將細胞團吹散，然后繼續在MEF上培養，挑選具有均一未分化形態的單克隆細胞團進行培養，如此重復培養至成系。hESC具有自我更新和分化的全能性的特點，注射到重癥聯合免疫缺陷的小鼠(severe?combined?immunodeficiency?mice，SCID)中，可獲得包含3個胚層分化細胞的畸胎瘤；體外懸浮培養hESC可發育成胚樣體(embryoid?body)，亦可檢測到3個胚層的細胞存在。

為使體外培養的hESC長久地保持未分化狀態，除特殊的培養條件外，需要與滋養層細胞(feeder?layer)共培養。培養層細胞(例如MEF)能分泌多種細胞因子，抑制hESC的自發分化(Martin，1981)。但由于MEF屬鼠源的特性，出于臨床應用的安全性考慮，為防止動物源性病原體的傳播，MEF作為培養層細胞培養hESC的臨床應用受到了極大的限制。研究人員嘗試開發人體組織作為培養層細胞，如胚胎皮膚、肌肉組織，成人輸卵管上皮細胞，尿道內皮細胞，包皮成纖維細胞，成體骨髓基質細胞等(Cheng?et?al.，2003；Hovatta?et?al.，2003；Inzunza?et?al.，2005；Lee?et?al.，2005；Richards?et?al.，2003)。然而這些細胞的實際取材非常困難，加上倫理學的限制，使其作為大規模臨床應用培養hESC的培養層細胞幾乎不可能。

因為hESC分離培養自人胚胎組織，倫理學問題極大的限制了它在臨床上的實際應用。2006年和2007年，日本科學家山中伸彌帶領的研究團隊分別發現了小鼠體細胞和人的成熟體細胞能通過人工方法誘導成具有hESC特點的多潛能干細胞，命名為人源性人工誘導多潛能干細胞(iPS：Induced?pluripotent?stem?cell)(Takahashi?K?et?al.，2006；Takahashi?K?et?al.，2007)，這一發現一舉克服了hESC應用范疇的倫理學問題，為若干非感染性疾病的治療開啟了希望之門。iPS細胞技術在全世界實驗室中逐漸被成熟和完善，其安全性也逐漸得到了加強，比如現在已不需要使用病毒介導即可達到誘導iPS細胞的目的，成瘤性問題也逐漸得到了解決(Kaji?et?al.，2009)。然而，iPS細胞的培養和hESC一樣，需要動物源性的MEF作為飼養層細胞才能使之保持未分化的狀態，這一問題成為了iPS臨床應用中的一大亟需克服的障礙和難題。

發明內容

本申請的發明目的在于克服現有技術的缺陷，而提供一種安全可靠地培養未分化的人源性人工誘導多潛能干細胞的方法。

為了完成本申請的發明目的，本發明采用以下技術方案：

本發明的一種用人羊膜間充質細胞作培養層來培養人源性人工誘導多潛能干細胞的方法，它包括以下步驟：

(1)用人羊膜間充質細胞的培養基，將體外的人羊膜間充質細胞培養在15cm的細胞培養瓶中達到80-90％融合；

其中：(2)去掉步驟(1)中的人羊膜間充質細胞的培養基，加入10ml新鮮人羊膜間充質細胞的培養基，在該培養基中加入100μl濃度為1mg/ml的絲裂霉素C混勻，然后將其放置于36.5-37.5℃的CO₂細胞培養箱中40分鐘，去掉含有絲裂霉素C的培養基，再用10ml?D-Hank′s平衡鹽溶液洗滌3次，再加入15ml的人源性人工誘導多潛能干細胞培養基備用；