[發明專利]用人羊膜間充質細胞作培養層來培養人源性人工誘導多潛能干細胞的方法

無效

• 申請號: 201010290415.9
• 申請日: 2010-09-25
• 公開（公告）號: CN102409022A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發明（設計）人: 李凌松;蔡哲;張可華
• 申請（專利權）人: 李凌松;蔡哲
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074
• 代理公司: 北京雙收知識產權代理有限公司 11241
• 代理人: 盧新

1.一種用人羊膜間充質細胞作培養層來培養人源性人工誘導多潛能干細胞的方法，它包括以下步驟：

(1)用人羊膜間充質細胞的培養基，將體外的人羊膜間充質細胞培養在15cm的細胞培養瓶中達到80-90％融合；

其特征在于：

(2)去掉步驟(1)中的人羊膜間充質細胞的培養基，加入10ml新鮮人羊膜間充質細胞的培養基，在該培養基中加入100μl濃度為1mg/ml的絲裂霉素C混勻，然后將其放置于36.5-37.5℃的CO₂細胞培養箱中40分鐘，去掉含有絲裂霉素C的培養基，再用10ml?D-Hank′s平衡鹽溶液洗滌3次，再加入15ml的人源性人工誘導多潛能干細胞培養基備用；

(3)將在15cm細胞培養瓶中生長到直徑為4mm-6mm的人源性人工誘導多潛能干細胞去掉多余的人源性人工誘導多潛能干細胞培養基，只在細胞培養瓶保留5ml的人源性人工誘導多潛能干細胞培養基，加入濃度為10mg/ml的膠原酶IV，使膠原酶IV的最終濃度為1mg/ml，混勻后置于36.5-37.5℃的CO₂細胞培養箱中15分鐘，去掉含膠原酶IV的人源性人工誘導多潛能干細胞培養基，用10ml?Knockout?DMEM洗滌3次后，再加入10ml人源性人工誘導多潛能干細胞培養基，用5ml移液管對準克隆的人源性人工誘導多潛能干細胞快速吹打，使其脫落在培養基中，對于貼附緊密的人源性人工誘導多潛能干細胞，可用移液管輕刮人源性人工誘導多潛能干細胞，用機械力使其脫落，待人源性人工誘導多潛能干細胞全部脫落在培養基后，再次吹打使其破碎成較小的人源性人工誘導多潛能干細胞的細胞團，然后將其轉移到4個預處理過的上述步驟(2)的培養瓶中，每瓶放入2.5ml；

(4)在室溫下，對步驟(3)培養瓶中的細胞進行培養，每隔1天更換一次人源性人工誘導多潛能干細胞培養基，待3-4天后長出肉眼可見的人源性人工誘導多潛能干細胞后，每天更換一次人源性人工誘導多潛能干細胞培養基，每隔7天傳代一次，待人源性人工誘導多潛能干細胞生長到4mm-6mm，重復步驟(3)或經過步驟(3)破碎成較小的人源性人工誘導多潛能干細胞的細胞團后進行使用。

2.如權利要求1所述的一種用人羊膜間充質細胞作培養層來培養人源性人工誘導多潛能干細胞的方法，其特征在于：步驟(1)包括以下步驟：將體外人羊膜間充質細胞放置在裝有人羊膜間充質細胞培養基的15cm細胞培養瓶中，待細胞密度達到90％融合以上，去掉培養基，用5ml?D-Hanks′平衡鹽溶液洗滌3次，再加入2ml?0.25％的胰蛋白酶放于36.5-37.5℃的CO₂細胞培養箱內2-3分鐘，在顯微鏡下觀察，待大部分細胞邊緣發亮時，拍打培養瓶，使細胞處于懸浮狀態，加入5ml的含有DMEM/F12和10％胎牛血清的終止液，將其轉移到50ml離心管中，加入30ml?D-Hanks′平衡鹽溶液，在室溫下將其放入離心機中以1000r/min的轉速離心5分鐘，然后將上述溶液中的上清液倒掉，再加入30ml人羊膜間充質細胞培養基使細胞重新懸浮，用移液管吹打均勻上述細胞，再將上述細胞平均種植到3個15cm細胞培養瓶中后，放置在36.5-37.5℃的CO₂細胞培養箱內，每隔3天換一次羊膜間充質細胞培養基，培養到在15cm的細胞培養瓶中達到80-90％融合。

3.如權利要求1或2所述的一種用人羊膜間充質細胞作培養層來培養人源性人工誘導多潛能干細胞的方法，其特征在于：所述的人羊膜間充質細胞的培養基包括：DMEM/F12、5％胎牛血清、2％B27、20ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子、20ng/ml的表皮生長因子和0.2g/l的L-谷氨酰胺。

4.如權利要求3所述的一種用人羊膜間充質細胞作培養層來培養人源性人工誘導多潛能干細胞的方法，其特征在于：所述的人源性人工誘導多潛能干細胞培養基包括：KnockoutDMEM、20％Knockout血清替代物、2mmol/l的L-谷氨酰胺、1×10^-4mol/l的非必需氨基酸、4ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子、0.5％的青霉素、0.5％的鏈霉素和1×10^-4mol/l的2-巰基乙醇。