[發(fā)明專利]具有透皮能力和白細(xì)胞介素-10活性的融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010290087.2
• 申請日: 2010-09-21
• 公開（公告）號: CN101962413A
• 公開（公告）日: 2011-02-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 肖衛(wèi)華;郭雨剛;溫龍平;張力;康文瑤;滿娜;李光偉
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/22;C07K1/16;C12N15/62;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12P21/02;A61K48/00;A61K38/20;A61K47/48;A
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及由具有“轉(zhuǎn)運(yùn)肽”和人白細(xì)胞介素-10活性的融合蛋白及其編碼基因，以及該融合蛋白的表達(dá)方法和在制備治療自身免疫性反應(yīng)特別是銀屑病藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)是一種多功能的細(xì)胞因子，能夠抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)，參與體液免疫調(diào)節(jié)。研究表明，IL-10在組織特異性自身免疫性損傷的啟動(dòng)和發(fā)展中起著關(guān)鍵性作用，并已應(yīng)用于包括I型糖尿病、銀屑病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、丙型肝炎等多種免疫性疾病的臨床實(shí)驗(yàn)研究。其中對銀屑病的治療效果表現(xiàn)最為明顯，歐美國家均已完成II期臨床觀察。

然而細(xì)胞因子這樣具有生物活性的藥物，半衰期太短，例如IL-10在體內(nèi)的半衰期僅僅2-3h，蛋白很快被清除，無法持續(xù)發(fā)揮治療作用，因而需要大劑量地頻繁使用才能達(dá)到有效的治療濃度，然而如此頻繁用藥很不方便且很痛苦，以致某些患者無法忍受該藥物治療。因此，迫切需要療效顯著，半衰期長且毒副作用小的IL-10。

同時(shí)在II期臨床觀察中也發(fā)現(xiàn)，IL-10使用劑量小則治療效果差；而提高劑量則產(chǎn)生明顯副作用。其原因主要由于注射給藥是目前蛋白質(zhì)類藥物的唯一給藥途徑，而由于IL-10屬強(qiáng)天然免疫抑制劑，系統(tǒng)性注射給藥時(shí)，可導(dǎo)致全身免疫抑制而出現(xiàn)副作用。

TD-1是最新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)含有11個(gè)氨基酸的透皮多肽，可幫助生物大分子(如胰島素、生長激素和熒光素)透過皮膚，進(jìn)入血液循環(huán)，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一透皮多肽，被認(rèn)為具有改變蛋白質(zhì)藥物給藥途徑的創(chuàng)新性突破。

因此，TD1成為了IL-10改變給藥途徑治療銀屑病的新切入點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種融合蛋白及其編碼基因。

本發(fā)明提供的融合蛋白，命名為TD1-IL10-IgG/Fc-γ1，人工合成，是在人白細(xì)胞介素10-蛋白的羧基末端連接如下任一所述蛋白，且在氨基末端連接轉(zhuǎn)運(yùn)肽形成的融合蛋白：

1)人IgG?Fc-γ1或其突變蛋白；

2)人IgG?Fc-γ2或其突變蛋白；

所述人白細(xì)胞介素-10蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2自氨基末端第12-171位的氨基酸序列；

所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽(TD1)的氨基酸序列為序列表中序列2自氨基末端第1-11位的氨基酸序列。

所述融合蛋白為如下1)或2)的蛋白：

1)序列表中的序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白；

2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有透皮能力和人白細(xì)胞介素-10活性的由1)衍生的蛋白。

上述序列表中序列2由403個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基(N)端第1-11位為TD-1的氨基酸殘基序列，自氨基端第12-171位為人IL-10的氨基酸殘基序列，自氨基端第172-403位為人IgG?Fc-γ1的氨基酸殘基序列。所述幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加為不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加。

編碼上述具有透皮能力和白細(xì)胞介素-10活性的融合蛋白的基因(TD1-IL10-IgG/Fc-γ1)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，是下述1)-4)中任一所述基因：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列1自5’末端第256-1464位核苷酸所示的DNA分子；

3)與1)或2)限定的DNA分子具有90％以上同源性且編碼具有透皮能力和人白細(xì)胞介素-10活性蛋白所示的DNA分子；

4)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA分子雜交的且編碼具有透皮能力和人白細(xì)胞介素-10活性蛋白所示的DNA分子。

所述嚴(yán)格條件為雜交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

上述序列表中的序列1由1464個(gè)堿基組成，其編碼序列為序列1自5’末端第1-1464位堿基，序列1自5’末端第1-255位堿基為具有Kex2單一蛋白酶酶切位點(diǎn)的α-Factor信號肽片段的編碼序列，序列1自5’末端第256-288位堿基為轉(zhuǎn)運(yùn)肽TD1的編碼序列，序列1自5’末端第289-768位堿基為人IL-10的編碼序列，序列1自5’末端第769-1464位堿基為人IgG?Fc-γ1的編碼序列。

含有所述融合蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、表達(dá)盒或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述重組表達(dá)載體為將所述融合蛋白的編碼基因插入pPIC9K的BamH?I和EcoR?I的識(shí)別位點(diǎn)間，得到重組表達(dá)載體pPIC9K-TD1-IL10-Fc-γ1。